[发明专利]一种用于HPV分型检测的试剂盒与方法

说明书

本发明提供了一种用于HPV分型检测的试剂盒与方法。所述试剂盒包括四种HPV的上下游引物组；DNA guides、不同荧光基团标记的四种分子信标、以及DNA编辑酶PfAgo；本发明根据HPV的E6基因或者L1基因靶序列设计高度特异性的引物、单链DNA guides和不同荧光基团标记的分子信标，利用PCR可以进行初步信号放大，然后通过磷酸化处理的单链DNA guides介导PfAgo的酶切，最后用分子信标进行第二步信号放大，通过荧光光度计来测得荧光信号的强弱对HPV进行分型。该方法具有特异性强，灵敏度高，对原始材料要求低，操作简单、快速、准确等特点，并且可以同时实现多种亚型的HPV分型检测。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于HPV分型检测的试剂盒与方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科(papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一种可引起人类黏膜组织良性及恶性肿瘤的病毒。HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，对宫颈癌的病因学研究可知，HPV感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段，而HPV检测则常用于宫颈癌的早期筛查，从而浓缩高风险人群，便于进行有效的监控、早期发现宫颈癌。HPV检测对尖锐湿疣、女性宫颈癌诊断有重要价值，不仅能判断是否感染HPV病毒，还能结合临床症状检测出其他可并发感染的因素。

常用的HPV测法方法主要有细胞学检查，感染组织中HPV蛋白的检测，HPV感染的血清学检查，HPV基因型检测。细胞学检测是根据HPV感染细胞后细胞出现凹空的形态学改变而区分于正常细胞，从而判断HPV感染的方法，该方法操作简单，但是细胞凹空样变也会由其他因素产生，并且细胞学检测易受取材、染色及医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性和假阳性率高、无法对HPV进行分型等缺点；感染组织者HPV蛋白的检测，主要是针对HPV衣壳蛋白制备抗体，通过免疫学方法进行检测，从而判断HPV有无，虽然操作简单，但是由于HPV不能在体外培养且其免疫原性较弱，因此该方法检测灵敏度低；HPV感染的血清学检测，是通过免疫学方法检测人体血清中是否存在有针对HPV产生的抗体而判断HPV感染，该方法原理明确操作简单，但是由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所以血清学检测不适于HPV感染早期的检测，并且对无免疫应答者也不适用。HPV基因组检测，主要有PCR类检测法、Southern杂交法、原位杂交和杂交捕获法。PCR法虽然灵敏度高但是容易发生样品交叉污染，从而导致假阳性率高，并且不适用于HPV分型；Southern杂交法特异性灵敏度均高，但是操作复杂费用高，必须应用新鲜组织标本，不宜大规模临床使用；原位杂交，利用HPV探针与HPV-DNA杂交形成杂交链，利于病理学分析，但是由于杂交链的稳定性不高，探针单链的复性导致杂交率降低，影响HPV-DNA的检出率；杂交捕获法，利用HPV-DNA 与RNA探针结合成DNA-RNA杂交体，再与结合有碱性磷酸酶的抗体结合，对抗体捕获信号的放大和化学发光信号检测HPV，灵敏度和特异性均较好，但是存在交叉污染并且检测费用昂贵，对HPV分型检测时筛选繁琐，成本高。

因此提供一种既有高灵敏度，高特异性又能对HPV进行分型，而且操作简单费用低的方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于HPV分型检测的试剂盒与方法，旨在解决目前HPV分型检测或灵敏度低或特异性差或成本高的问题。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一在于提供一种用于HPV分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括四种HPV的上下游引物组；DNA guides、不同荧光基团标记的四种分子信标、以及DNA编辑酶PfAgo；

所述四种HPV的上下游引物组包括：