[发明专利]基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒在审
申请号: | 201910574965.4 | 申请日: | 2019-06-28 |
公开(公告)号: | CN110184334A | 公开(公告)日: | 2019-08-30 |
发明(设计)人: | 徐秦峰;马西亚;贺晓玲 | 申请(专利权)人: | 陕西科技大学 |
主分类号: | C12Q1/686 | 分类号: | C12Q1/686 |
代理公司: | 西安通大专利代理有限责任公司 61200 | 代理人: | 范巍 |
地址: | 710021*** | 国省代码: | 陕西;61 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 高分辨熔解曲线 多重PCR检测 检测 试剂盒 熔解 饱和荧光染料 多色荧光标记 主成分分析 分析引物 鉴别检测 空间分隔 扩增反应 熔解曲线 形状信息 多重PCR 靶序列 差异化 高分辨 归一化 单管 扩增 通量 平行 采集 污染 应用 | ||
本发明公开了一种基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒。本发明采用PCR饱和荧光染料,扩增完成后直接进行高分辨熔解,对采集的熔解曲线进行归一化、差异化或主成分分析,即可实现单管有效同时检测多个靶序列的目的。根据高分辨熔解曲线形状信息而非熔解温度来进行鉴别检测,显著降低了多重PCR分析引物的设计难度,使得具有微小Tm差异的多个PCR扩增产物能够同时检测;避免了开管操作造成目的DNA被污染的可能性,弥补了多色荧光标记或者空间分隔平行下的单重扩增反应成本较高的缺陷,提高了检测通量,降低了检测成本,具有较强的实际应用价值。
技术领域
本发明属于分子生物学鉴定技术领域,具体涉及根据高分辨熔解曲线形状同时检测多个靶标目的基因的多重实时荧光PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
多重PCR(multiplex PCR)又称复合PCR,是在常规PCR基础上发展起来的一种PCR技术,其可在同一个PCR体系中通过加入两对或两对以上的引物同时扩增多个靶目标片段。相对于单重PCR技术,多重PCR具有检测效率高、节约成本的优点。
目前,同时检测多个靶目标片段(例如,来自不同物种)的方法包括电泳分析、测序分析以及空间分离法。电泳分析的原理是先通过PCR技术扩增待检测的片段,直接或者使用限制性内切酶剪切之后,通过电泳分析片段大小以及数量,进而达到区分不同靶目标片段的目的,该方法耗时、费力且无法进行大规模检测,此外,对于片段差异小于10bp的靶目标片段难以进行区分;测序分析对于大批量样品的检测价格相对比较昂贵,而且测序和电泳都需要开管后操作,增加了样品产生气溶胶的污染风险;空间分离法则是通过空间并行的多个单反应检测予以实现,其中,对于不用开管操作的方法,多色荧光检测能够在闭管中实现多个目标序列的特异性检测,但其需要进行多色荧光标记且对仪器的要求也相对较高,需要多通道光学元件。探针法则需要针对每一对引物设计特异性探针,要求较为严格且价格昂贵,提高了检测成本。
熔解温度分析为同时单管检测多个靶目标片段提供了一种简单、闭管、成本低的可行性方法。不同的靶目标片段由于长度以及GC含量的差异导致其产生不同的熔解温度,可以用于区分多个靶目标片段。但采用此方法有一定的局限性,一方面对引物设计要求较高,要求每一引物具有良好的特异性,无引物二聚体和非特异性扩增生成,且不同的靶目标片段Tm(熔解温度)值相差大于2℃,另一方面要求多对引物处在同一个反应体系,各引物具有相同或相近的退火温度,并且彼此之间没有相互干扰,使得反应体系和反应条件的优化困难,且往往满足这些要求之后,难以保证扩增产物之间的Tm差值能够有效区分Tm接近的靶目标片段,这些都使该技术的推广受到限制。因此,建立一种简单易行且可以同时检测多种动物源性成分的检测方法,从而提高检测效率,一直是有待解决的问题。
高分辨熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析属于荧光PCR检测技术,主要原理是:双链DNA的熔解行为决定于DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性的差异,通过在熔解过程中实时监测DNA饱和荧光染料信号的改变获得特征熔解曲线,同时,借助于专业性的分析软件就可以实现基于不同形状熔解曲线的检测样品基因分型或归类。例如,中国专利CN109868322A利用通用引物扩增不同动物源性成份的某段DNA片段,尽管避免了设计多对引物,但是,通过对高分辨熔解曲线的差异化等分析,即根据高分辨熔解曲线的形状(轮廓),尚无法区分熔解温度相似性较高(Tm相差0.5±0.1℃以内)的扩增靶序列所对应的不同动物源性成份,并且由于使用的是通用引物,PCR扩增反应的特异性较低。
而现有多重实时荧光PCR,例如,中国专利CN109868321A,针对山羊基因组中的靶序列的扩增产物的长度、GC含量,对引物进行了复杂的设计,以便通过观察熔解峰的位置实现同时鉴别熔解温度相似性较高(Tm相差0.5±0.1℃以内)的靶序列,但引物设计难度较大(增加整个扩增片段GC%的比值或者长度,将扩增片段Tm增加到期望值)。
发明内容
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