[发明专利]一种延迟家蚕化蛹的方法

权利要求书

1.一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：

(1)家蚕BmNPV编码的EGT基因的克隆：以家蚕核型多角体病毒BmNPV的基因组为模板，利用PCR方式克隆获得EGT基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，获得pCR2.1-EGT；

(2)含有EGT基因的重组杆状病毒的构建：

用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-EGT得到EGT基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-EGT；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内与BmNPV DNA同源重组产生重组病毒；在离心管中加入1μg的pBlueBacHisA-EGT DNA和15μg的BmNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞，再用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有质量浓度为10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清液作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒；重组病毒用病毒储存原液通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml；

(3)家蚕培养细胞内表达重组EGT蛋白：使用家蚕培养细胞BmN，在培养基中加入上述浓度为10⁶pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养，培养96小时后收集细胞和上清液；将收集的细胞和上清液作为重组EGT蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后再收集上清液；用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得重组EGT蛋白；

(4)家蚕经口添食EGT蛋白：在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组EGT蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下重组EGT蛋白，由此实现延迟家蚕化蛹。

2.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：94℃模板变性3分钟；30个循环，94℃变性30秒，57℃退火50秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟。

3.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，引物设计如下：正向引物：5'-AGGGATCC CTAAAAGTGTGCTATATG-3'，如SEQ ID NO.1，含有BamHI酶切位点，反向引物：5'-GAAGCTTGCAATAACTTGCTGTCCT-3'，如SEQID NO.2，含有HindIII酶切位点。

4.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：

所述步骤(3)中，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化获得重组EGT蛋白，具体为：将该上清液结合于Ni-NTA柱，随后用硫酸缓冲液进行漂洗，最后用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，获得重组EGT蛋白。

5.根据权利要求1所述的一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：

所述步骤(3)最后，获得重组EGT蛋白后通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组EGT蛋白。