[发明专利]一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法

说明书

一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，属于疫苗技术领域。本发明解决技术问题的技术方案包括以下步骤：培养细胞PK15、G418的适用浓度应为500μg/mL、将LipofectamineTM2000与pEGFP‑N1‑VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞、G418筛选、弱酸洗脱得到SLA‑I类呈递肽。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法。

背景技术

口蹄疫(FMD)是一种高度传染性、毁灭性的家畜传染病。以前，口蹄疫在非洲、南美和亚洲地区广泛传播，导致牲畜产量显著下降，对畜牧业造成严重的经济影响。目前，口蹄疫每年都在养猪业蔓延，对猪养殖业造成了严重的影响。根据血清学试验，FMDV一共可分为7种血清型：A、O、C(欧洲类型)；Asia 1(亚洲1类型)；SAT1,SAT2和SAT3(南非类型)。FMDV由60个颗粒组成，每个颗粒主要由4个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成。FMDV结构蛋白VP1是主要的抗原片段，在诱导动物免疫方面起着至关重要的作用。因此，研究FMDV结构蛋白VP1对于开发疫苗具有重要意义。

目前，在口蹄疫流行地区用来防治口蹄疫的措施是注射传统的口蹄疫灭活疫苗，这些灭活疫苗是通过将活的病毒经过化学方法灭活的，可能存在化合物残留及灭活不彻底的现象。以前也曾使用过传统的减毒活疫苗，但后来人们发现它具有严重的生物安全风险，有时FMD可以在接种期间发生毒力增强的现象。另外，通过血清学检查很难区分动物是否属于病毒感染还是接种疫苗。因此，在一些西欧国家，口蹄疫的灭活和减毒疫苗都禁止使用。目前，研究人员已经在尝试一种新的疫苗来替代传统疫苗，这种疫苗由许多位于抗原免疫决定区的短肽组成，且不携带任何病毒基因，是一种安全性更高的多表位疫苗。病毒表位由B细胞表位、辅助性T细胞(Th)表位和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位组成。以前对FMDV抗原的研究主要集中在B细胞和Th表位的研究，而对CTL表位的研究较少。最近的研究表明,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位与主要相容性复合体(MHC)I类重链的多肽结合槽结合，同时与轻链β₂微球蛋白(β₂m)以非共价键结合。研究表明，一旦这些表位被递呈到细胞表面，就会在体内引起细胞免疫，从而在抵抗口蹄疫病毒方面起重要作用。

为了筛选口蹄疫病毒VP1蛋白的CTL表位，人们已经尝试了多种措施，包括构建猪主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I类分子，亦即猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)I类分子重链和轻链的共价复合体筛选口蹄疫病毒的抗原肽；以及将分别表达的重链、轻链和口蹄疫多肽进行复性的方法。然而，这些措施均属于在体外筛选SLA-I类分子结合的多肽，筛选的多肽不属于在体内经SLA-I类分子自然递呈的多肽，也就是说，这些方法筛选到CTL表位的效率较低。此前，研究人员曾尝试从人或小鼠MHC I类阳性表达细胞株表面采用温和酸洗脱法提取多肽，并且证明分离的抗原肽是由MHC I类分子自然表达的，属于功能性多肽，可以用于疫苗研制。迄今为止，还没有建立猪细胞系筛选和分离源自FMDV的抗原肽。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，该方法可以有效分离出自然递呈抗原肽。

本发明解决技术问题采用的技术方案包括以下步骤：

(1)培养细胞PK15；

(2)配制浓度为500μg/mL的G418溶液；

(3)确定Lipofectamine^TM2000与pEGFP-N1-VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞；

(4)G418筛选；

(5)弱酸洗脱得到SLA-I类呈递肽。

有益效果：