[发明专利]一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法

权利要求书

1.一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法，包括以下步骤:

1）采集监测区域的海水样本；

2）提取海水样本中的总DNA；

3）利用特异性引物对总DNA 进行qPCR扩增；

4）根据扩增结果进行监测结果判定；

5）二次验证；

步骤1）中，所述海水样本的采集方法为：用消毒后的采集器收集水样，等量收集采集点表层、中层以及底层海水并混合，水样用普通滤网过滤后，再用混合纤维素滤膜过滤，滤膜折叠沉没无水乙醇中冷冻保存；

步骤3）中，所述特异性引物的序列为：正向引物，5'-CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC-3'；反向引物，5'-GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT-3'；

所述qPCR扩增过程中，反应体系为：TB Green Premix Ex TaqGC 10μL，模板DNA 2μL，正向引物与反向引物各0.5μL，ddH₂O 7.2μL，总体系20.2μL；

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸 1min，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存；

扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃，通过连续测定扩增对象的荧光强度以获得熔解曲线；

步骤4）中，所述监测结果判定的方法为：当海水样本的Ct值小于25，熔解曲线的峰值在82℃而且峰型尖锐无锯齿，说明海水样本中含有中华白海豚的eDNA；

步骤5）中，所述二次验证的过程为：将步骤3）中获得的扩增产物纯化，导入载体，再转入感受态细胞克隆，提取质粒，将提取的质粒进行测序，将测序结构与核苷酸序列数据库进行对比；

所述克隆的过程为：选用DH5α作为感受态细胞，将导入载体的感受态细胞先接种在SOC培养基上，37℃摇床培养1 小时，然后接种在含有氨苄青霉素的LB 固体培养基上，37℃培养12-16 小时，最后挑取白色菌落接种在 SOC 培养基上，37℃摇床培养 24 小时。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述消毒的方法为：先用次氯酸消毒，然后用无菌水冲洗，最后用紫外线灭菌。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述总DNA的提取方法为：将滤膜用无菌剪刀剪碎，通过珠磨式组织研磨器匀浆，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；或者，将滤膜放入无菌水中高速震荡10 min，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；或者，将滤膜用无菌剪刀剪碎，CTAB缓冲液浸泡后，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA。