[发明专利]人工转染获得稳定感染Cardinium的褐飞虱新品系的方法

权利要求书

1.人工转染获得稳定感染Cardinium的褐飞虱新品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）飞虱卵的收集：解剖感染Cardinium的白背飞虱与未感染Cardinium的褐飞虱产过卵的水稻苗，用镊子剖出新产的卵，以感染Cardinium白背飞虱的卵为人工转染的供体，未感染Cardinium的成熟褐飞虱的卵为人工转染的受体；

（2）飞虱的卵的人工转染：用显微注射仪吸取供体卵的细胞质并快速地注射到受体胚胎的后部，注射后的卵转移到湿润的滤纸上，将存活的有眼点的卵转移到新滤纸上直到其孵化为若虫；将若虫饲养直到其羽化为成虫G₀；

（3）注射后飞虱的筛选：将G₀雌成虫与不感染雄成虫配对后检测其感染状况，所产生的子代记为第一代G₁，并进行PCR检测，将Cardinium阳性G₁雌成虫与不感染雄虫交配，子代即为Cardinium稳定感染的第二代G₂，即获得稳定感染Cardinium的褐飞虱新品系；

所述PCR检测为：

以褐飞虱DNA为模板，采用一对靶定Cardinium的16S rRNA序列的引物，检测褐飞虱的Cardinium感染状况，所述靶定Cardinium的16S rRNA序列的引物为：

SEQ ID NO.1所示CLO-F: 5’-GCGGTGTAAAATGAGCGTG-3’，

SEQ ID NO.2所示CLO-R: 5’-ACCTMTTCTTAACTCAAGCCT-3’ ，

或者

SEQ ID NO.3所示16S rRNA–F:5’-CGG CTT ATT AAG TCA GTT GTG AAA TCC TAG-3’，

SEQ ID NO.4所示16S rRNA–R:5’-TCC TTC CTC CCG CTT ACA CG-3’；

同时采用一对靶定Wolbachia的wsp基因序列的引物，检测共生菌Wolbachia的感染状况，SEQ ID NO.5所示wsp-F:5’-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC-3’，

SEQ ID NO.6所示wsp-R:5’-AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA -3’；

对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Cardinium的16S rRNA引物可扩出条带的为阳性，Wolbachia检测为阴性，说明为感染Cardinium的褐飞虱。

2.根据权利要求1中所述的人工转染获得稳定感染Cardinium的褐飞虱新品系的方法，其特征在于，本方法还包括（4）Cardinium分布和垂直传播率的检测：取第二代G₂褐飞虱新品系的雌虫与不感染的雄虫杂交，对产生的后代的Cardinium和Wolbachia的感染情况进行PCR检测，连续检测3~5代。

3.根据权利要求2中所述的人工转染获得稳定感染Cardinium的褐飞虱新品系的方法，其特征在于，所述连续检测为连续检测3代，从而可以确定Cardinium垂直传播率以及共生关系的稳定性。