[发明专利]用于检测碱性磷酸酶的、基于连接酶扩增反应催化组装的单量子点纳米传感器及应用

说明书

本发明涉及用于检测碱性磷酸酶的、基于连接酶扩增反应催化组装的单量子点纳米传感器及应用。首次采用连接反应对碱性磷酸酶的活性信号进行识别和放大：在碱性磷酸酶存在时，催化检测探针的3’‑磷酸末端去磷酸化生成3’‑羟基末端，此后利用热稳定的DNA连接酶触发Cy5探针和生物素探针的循环重复连接，产生多个Cy5‑生物素双标记信号探针；信号探针通过链霉亲和素‑生物素的特异性相互作用在605量子点的表面完成自组装，实现从605量子点到Cy5的高效荧光共振能量转移(FRET)，最后利用单分子荧光检测技术进行检测。相反，当不存在碱性磷酸酶时，则检测不到荧光共振能量转移信号。仅需一种热稳定连接酶即可实现超高的检测灵敏度，检测限低至5.63×10^‑7单位每毫升。

技术领域

本发明属于酶活力检测领域，具体涉及基于连接酶扩增反应催化组装的单量子点纳米传感器用于检测碱性磷酸酶。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

碱性磷酸酶(ALP)是一种在原核生物和真核生物中广泛存在的水解酶，可以在碱性条件下催化去除磷酸化的蛋白质、核酸、糖及其他生物分子上的磷酸基团，在细胞分裂、骨生成等正常生理功能中起着关键作用；同时，细胞内碱性磷酸酶水平失调与低磷血症、轴性脊柱炎、骨疾病及癌症等多种人类疾病密切相关，这使其成为临床相关疾病诊断的潜在生物标志物。此外，碱性磷酸酶也是酶免疫分析、组化染色和DNA杂交分析等生物分析中最常用的生物信标之一，因此，高效的碱性磷酸酶活性生物传感器对与其相关的生物学研究、临床诊断和生物分析应用具有重要的意义。

此前，已经建立了各种基于比色检测、化学发光检测、表面增强拉曼散射检测和荧光检测的碱性磷酸酶活性测定方法。上述方法通常使用非核酸底物如对硝基苯酚磷酸盐(PNPP)、三磷酸腺苷(ATP)、鸟苷一磷酸(GMP)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐等，尽管也有着出色的性能，但因为这些非核酸底物在检测过程中不能像核酸那样进行扩增以放大信号，使得这些方法的分析灵敏度很难再提升。目前，只有少数方法采用核酸扩增的策略来实现高灵敏度的碱性磷酸酶检测。然而，这些方法都需要引入多种酶才能完成信号放大步骤；如，分子信标启动的T7核酸外切酶介导的信号扩增方法需要使用KF聚合酶和T7核酸外切酶，循环指数扩增方法需要使用Vent聚合酶和Nt.BstNBI切口酶，转录反应介导的双信号扩增方法需要使用λ核酸外切酶和T7 RNA聚合酶以及双链特异性核酸酶，这不仅会增加分析成本，同时也使分析过程变得复杂。此外，由于非特异性的核酸外切酶消化和DNA背景扩增，这些分析方法的检测准确性也可能受到损害。

DNA连接酶通过在并列的5'-磷酸末端和3'-羟基末端之间形成磷酸二酯键来催化连接两条独立的DNA链。由于极高的保真度和连接效率，DNA连接酶被广泛应用于生物传感领域；此外，通过使用单一的热稳定连接酶重复进行链连接反应很容易地实现信号的循环放大。如，连接酶检测反应通过对2条靶标特异性探针的连接能实现信号的线性放大，而连接酶链式反应通过重复连接两对探针可以达到指数信号放大的效果。这些高特异性、高灵敏度的连接反应在DNA、RNA、microRNA、蛋白质和活性酶等生物分子的检测中有着广泛的应用，但目前连接反应用于碱性磷酸酶活性检测的方法还未见报道。

量子点(QDs)具有高光稳定性、高量子产率、宽吸收光谱、窄尺寸可调谐发射光谱和大斯托克斯位移等优良的光物理性质，是一种很有吸引力的生物传感器构件。此外，引入单分子检测构建的基于单量子点的纳米传感器具有分析时间短、信噪比高、样品消耗量低、灵敏度超高等优良的分析性能。但目前基于量子点的碱性磷酸酶活性检测方法仍存在选择性低和灵敏度不高的问题。

发明内容