[发明专利]一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌，其特征在于，于2019年4月15在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019262。

2.一种构建权利要求1所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将融合基因融组成型启动子pJ23101、密码子优化后的甲酰胺酶基因、亚磷酸脱氢酶基因及连接这两个基因的接头序列Linker连接在一起，组成融合基因pJ23101-fmdA-linker-ptxD；

（2）将步骤（1）人工合成得到的pJ23101-fmdA-linker-ptxD基因片段利用BsrG I和XhoI双酶切后，连接入相同酶切的pETDuet-1质粒上的第二个多克隆位点，得到重组质粒pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，并转化入大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD)；

（3）将人工合成绿色荧光蛋白基因gfp插入pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD质粒的第一个多克隆位点，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，转化入大肠杆菌DH5α中；

（4）以pTargetF-N₂₀为模板，A1和A2为引物，其中N₂₀为T7噬菌体DNA装配蛋白部分基因，扩增得到pJ23119-N₂₀-sgRNA； PCR扩增条件为94℃反应3-5 min；再依次于94-98℃反应10-15s、50-55℃反应5-30s、72℃反应80-120s，并循环30次；最后于72℃反应7-10min，最后降温至4℃保存PCR产物；利用重组酶无缝把得到的PCR片段连接入经Pci I单酶切后的pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N₂₀-sgRNA，并转化入大肠杆菌DH5α；

（5）上下游引物C1和C2；以pCas质粒作为模板，进行全质粒扩增，扩增的条件与步骤（3）相同，延伸时间增加到12-14min，扩增得到的DNA片段pCas-pJ23119-N₂₀-sgRNA转化入大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pCas-pJ23119-N₂₀-sgRNA)；

（6）从重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N₂₀-sgRNA)中提取重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N₂₀-sgRNA，并从重组大肠杆菌DH5α(pCas-J23119-N₂₀-sgRNA)中提取重组质粒pCas-pJ23119-N₂₀-sgRNA；将重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N₂₀-sgRNA和pCas-J23119-N20-sgRNA共转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N₂₀-sgRNA+pCas-J23119-N₂₀-sgRNA)；

（7）将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N₂₀-sgRNA+pCas-J23119-N₂₀-sgRNA)接种到LB培养基中，摇瓶培养后，收集菌体然后加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养重组大肠杆菌12-15小时，得到所述抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌。