[发明专利]滑液囊支原体和鸡毒支原体的四重PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种同时检测滑液囊支原体（MS）和鸡毒支原体（MG）的四重PCR检测试剂盒，包括4对特异性引物，该引物具有高度的保守性和特异性，在一次PCR反应中鉴定滑液囊支原体和鸡毒支原体的同时，还可进一步区分出鸡毒支原体弱毒疫苗株F株和野毒株，经试验证实，本发明提供的检测试剂盒比常规的细菌分离鉴定灵敏度高且检测快速，可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种利用多重PCR技术快速检测滑液囊支原体和鸡毒支原体以及鸡毒支原体疫苗株F与野毒株的试剂盒。

背技景术

在我国禽类的养殖场中禽支原体感染率很高，禽支原体不仅可以进行水平传播，也可经种蛋垂直传播，长期存在于鸡群中，反复感染，常继发和或混合感染其它病原，给养禽业造成比较严重的隐性经济损失，也给养殖场的疾病防控带来隐患。目前国内外重要的禽支原体主要有鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)。MG是引起鸡慢性呼吸道病和火鸡传染性窦炎的主要病原，感染鸡群常出现啰音、咳嗽、呼吸道粘膜卡他性炎症等症状，造成肉鸡胴体品质下降，种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等，而且经常与其它病原如大肠杆菌等细菌或(和)病毒混合感染，加重病情，使疾病复杂化，从而造成较大的经济损失。滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)主要引起鸡的呼吸道感染，主要表现为亚临床性，一般不易察觉，如果并发感染鸡新城疫和传染性支气管炎，则引起气囊病变，但其程度远比MG感染引起的低。但MS感染可引起鸡的传染性滑膜炎，呈慢性感染过程，导致关节病变，出现跛行，影响仔鸡和蛋鸡的生产性能，免疫功能下降，增强其他传染病易感性。在临床上，MG与MS很难进行鉴别诊断。目前某些MS菌株因为在感染后呈隐性的呼吸道症状，控制不及时或不当，引起鸡的腱鞘炎、滑膜炎，影响鸡群生产性能，进而导致鸡群出现跛行，使蛋鸡产蛋量下降，肉鸡生长不良、胴体品质降低，对养禽业产生严重影响。

尽管禽支原体检测方法有病原分离、血清学检测方法、分子生物学检测方法等。但如何有效的快速检测和鉴别MG和MS，尤其如何快速有效地早期诊断MS是国内养鸡业所面临的亟需解决的重要问题。

使用疫苗免疫接种是防控支原体感染的重要举措，尽管由于近10年MS的危害日趋严重，国内还没有商品化疫苗，也尚未引进MS弱毒疫苗。而国内防治MG常应用商品化的弱毒疫苗或灭活油乳剂苗进行预防接种，其中弱毒疫苗的免疫效果优于灭活疫苗，但鸡群中使用弱毒疫苗，会导致鸡群长期受到疫苗株的污染，干扰MG的检测，影响鸡群MG的控制和净化。另外MG疫苗免疫不能阻止MG水平传播，因此存在部分鸡群会出现免疫后感染的情况。建立一种可以鉴别MG野毒株与MG弱毒疫苗株F(MG-F)，尤其是混合感染的检测方法，为及时准确地掌握鸡群内MG感染情况提供必要的技术支持。

在实际生产中，鸡毒支原体与滑液囊支原体在临床症状上较难区分。传统检测方法如分离鉴定法和血清学方法，不仅程序繁杂，工作量大，很难区分MS和MG，也根本无法区分鸡毒支原体野毒株与疫苗株F。尽管国内有学者曾报道MG强弱毒株的PCR诊断方法(多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究[J].中国预防兽医学报,2003(06):77-80；鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立[J].中国兽医学报,2013,33(08):1206-1211.)，但不能区分强弱毒株混合感染的情况。目前虽有关于鸡毒支原体与滑液囊支原体双重PCR检测方法以及鸡毒支原体强弱毒株鉴别方法，如专利“鉴别鸡毒支原体强弱毒株的LAMP检测试剂盒”(CN201210075432.X)，“一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法”(CN201610600687.1)，但是已公布的这些方法均无法实现同步检测MG与MS以及MG-F与MG野毒株。

目前，还没有采用多重PCR方法一次性检测出MG与MS，并同时区分疫苗株F株和MG野毒株。同时鉴别诊断MS与MG以及MG疫苗株F株与野毒株对鸡场支原体检测与净化具有重要意义。