[发明专利]一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统及其应用

说明书

本发明公开了一种基于铜绿假单胞菌群体感应系统的基因开关系统及其应用，该基因开关系统包括铜绿假单胞菌的信号分子蛋白基因lasI，受体蛋白基因lasR和可以感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PlasI。本发明基因开关系统是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在合适的OD₆₀₀状态下启动靶基因表达的发酵工程菌。本发明将基因元件分别构建到不同的表达载体上，本发明在工程菌内部构建了一个基因开关，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的群体感应系统的基因开关系统及其应用。

背景技术

发酵工程菌需要合成大量重组蛋白，搭建合成通路，如果在培养起点就开始大量表达重组蛋白会和细胞代谢竞争胞内资源，给菌体带来巨大的负担，代谢网络失衡会导致一些有毒的中间产物的积累，也会对菌体生长造成毒害，使菌株无法保持良好的生长状态，影响最终产物的产量。因此前人探索了多种操纵元件，实现对基因的诱导调控，包括：色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子以及许多杂合操纵子等，其中以受IPTG诱导的乳糖操纵子应用最为广泛。诱导型启动子有许多优点，包括能通过调节诱导剂浓度调节基因表达强度、通过控制诱导剂添加时间控制基因表达的启动时间以平衡菌体的生长和产物的合成等。但是诱导型启动子也存在许多问题，包括无法实现靶基因的动态调控、对细胞状态无法及时反馈等。另外，诱导剂昂贵的价格阻碍了其在大规模工业化生产中的应用。

解决这一问题的方法之一就是在发酵菌株内引入动态的基因开关来控制途径基因的表达，目前已经有许多这方面的尝试。但是这些策略需要响应于特定的中间产物、细胞状态或者培养基组成，缺乏普适性，无法应对复杂多变的产物需求。而群体感应(Quorumsensing)系统作为细胞密度的监控感应系统同时具有动态调节和通用性的优点。因此，基于群体感应的动态调节系统具有很高的研究价值以及应用前景。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的病原菌，属于革兰氏阴性，通过高丝氨酸内酯介导的群体感应系统调控其生命活动过程。包括毒力因子的表达、生物膜的形成、抗生素排出泵的表达以及运动性等。铜绿假单胞菌的群体感应系统是费氏弧菌群体感应系统研究的延伸，铜绿假单胞菌群体感应系统相关元件和费氏弧菌LuxI/R系统有显著的同源性，但是铜绿假单胞菌的群体感应系统更为复杂。铜绿假单胞菌群体感应是一个复杂的层次网络，包含了Las和Rhl两套群体感应系统，它们相互独立又相互关联。Las系统中，lasi基因控制信号分子3OC₁₂-HSL(PAI 1)的形成，信号分子合成后分泌到胞外环境，当累积到一定的浓度后会和LasR结合并激活大量毒力因子基因表达。包括：lasB、lasA、apr、toxA和lasI自身，实验证明缺失有活性的LasR蛋白的铜绿假单胞菌对动物无害。有研究通过实时荧光定量PCR探索了铜绿假单胞菌通过群体感应系统控制的与生物膜合成相关的基因，发现algD、pslA、pelA、LasI、lasR、RhlA等一系列基因与生物膜的合成密切相关。

Rhl系统中，rhl催化N-butyryl-L-HSL(PAI2)的合成，该信号分子和RhlR结合后可以激活负责鼠李糖脂合成的rhlAB基因、负责信号分子蛋白合成的rhli基因和lasB基因的表达。Rhl系统也负责一些毒力因子表达，包括绿脓菌素、氰化物和几丁质等。这两个系统之间存在级联调控，Las系统控制转录激活蛋白RhlR的表达，因此Rhl系统控制的基因需要有完整且有活性的Las系统才能被完全激活。两种系统同时调节多种基因表达，包括合成弹性蛋白酶、分泌蛋白、过氧化氢酶、外毒素、外凝集素、酰基高丝氨酸内酯和超氧化物歧化酶等多种毒力因子基因的表达。PAI I会阻碍PAI II和RhlR的结合，确保两套系统分别在合适的时间运行。