[发明专利]一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物RT-RPA检测试剂盒与检测方法

说明书

本发明公开了一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物RT‑RPA检测试剂盒与检测方法，其试剂盒包括2条特异性引物：SPLV‑lotusRPA‑F：GTCAACCATCCGCAACACCACCACAGTCAA；SPLV‑lotusRPA‑R：TCTTTGTGGGTATTGCAC GCAGCCGAGGTA，Prime Script™Reverse Transcriptase反转录酶、Oligo(dT)₁₅Primer、Ribonuclease Inhibitor抑制酶、dNTP、DNA Marker、pMD18‑T载体、RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、TwistAmp®DNA amplification kits和Mg²⁺。本发明以在非实验室的条件下完成核酸扩增，在分子水平上为甘薯潜隐病毒莲藕分离物的检测提供了一种快速、灵敏、高通量的方法，适用于大量莲藕样品的检测。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物RT-RPA的检测试剂盒与检测方法。

背景技术

莲藕(Nelumbo nucifera)是睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，有三千多年的栽培历史，生产上可分为藕莲、籽莲和花莲。莲藕富含淀粉、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，是我国南方地区的主要水生蔬菜，其栽培面积近40余万hm²。

甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus，SPLV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，是1979年在中国台湾的甘薯上首次发现的，其介体昆虫为蚜虫，可随薯苗营养繁殖体及薯块传播。甘薯潜隐病毒具有变种和多样性(比如甘薯潜隐病毒莲藕分离物(Sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus)，是本实验室前期在莲藕中发现的一种甘薯潜隐病毒新型分离物)。江苏省莲藕主产区SPLV-lotus感染越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势，因此脱毒莲藕种苗的应用迫在眉睫。

发明内容

本发明目的在于提供一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus重组酶聚合酶扩增的检测试剂盒与检测方法。

甘薯潜隐病毒莲藕分离物(Sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus)，是本实验室前期在莲藕中发现的一种甘薯潜隐病毒新型分离物。该分离物与SPLV甘薯分离物具有很大的遗传差异，核苷酸相似性在76.28％-76.60％之间，与最新的国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)制定的马铃薯Y病毒科病毒的分种标准相同，且该分离物与SPLV甘薯分离物有四个蛋白酶水解切隔识别位点存在差异，其编码的PIPO的长度差异较大。SPLV-lotus自然条件下能够侵染莲藕，并且能有效侵染豆科、藜科、葫芦科、茄科植物，但未见明显的症状表现。2016年，我们在江苏省莲藕产区首次发现SPLV-lotus，后续调查发现，SPLV-lotus在江苏省莲藕主产区发生越来越普遍，部分地区呈现流行爆发趋势。因此，发展SPLV-lotus的精确检测鉴定技术迫在眉睫。RPA是一种新型等温扩增技术，可以在非实验室的条件下完成核酸扩增，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点。目前，RPA技术已经被应用于病毒、致病菌、转基因等领域的检测。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种甘薯潜隐病毒莲藕分离物SPLV-lotus重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)的检测试剂盒，其特征在于，包括2条针对SPLV-lotus CP基因设计的特异性引物：

SPLV-lotusRPA-F：GTCAACCATCCGCAACACCACCACAGTCAA；

SPLV-lotusRPA-R：TCTTTGTGGGTATTGCACGCAGCCGAGGTA。