[发明专利]一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法

说明书

本发明公开了一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，通过S1基于麦管制作的胚胎玻璃化冷冻Tip载体的制备、S2冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存、S3冷冻Tip载体的猪囊胚的解冻等步骤，从而实现猪囊胚的高效冻存和解冻。本发明一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，技术简单，操作便捷，不需要操作人员多大的熟练度，成本低、效率高，显著降低胚胎玻璃化冷冻与解冻过程中的胚胎损伤和丢失的发生率，可以很好地应用于人类生殖医学和畜牧业的推广发展。

技术领域

本发明涉及生物工程及胚胎遗传技术领域，具体为一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法。

背景技术

随着医学和生物技术的发展，无论从人类辅助生殖以及珍贵哺乳动物胚子和胚胎的保存还是保存地方性种畜的生物多样性或者基因编辑模式动物的保存等，哺乳动物胚胎的玻璃化冷冻技术都做出了很大的贡献。并且利用配子和胚胎冷冻技术运输会更经济并且可以降低疾病传播的风险。

1985年Rall W.F.首次应用玻璃化冷冻技术成功保存8-细胞小鼠胚胎并且在解冻后使胚胎继续发育到囊胚，这是人类首次成功的利用玻璃化冷冻技术保存哺乳动物的胚胎。之后玻璃化冷冻技术逐渐的应用于牛、羊、猪和人等卵母细胞和早期胚胎的低温保存。玻璃化冷冻技术是利用超速降温的方法使胚胎快速通过“危险区”(冰晶形成)，使细胞中的水保持一种类似玻璃的无序状态，减少冰晶的形成降低冷冻损伤，从而提高细胞的存活率。通过降低保护液体积的微滴法在这个原则上被开发出来，可以保持微滴状态的各种载体尤为重要，目前主要使用的主要有Cryotop，OPS，SOPS，尼龙膜，固体表面等作为冷冻载体。目前人类卵母细胞和早期胚胎的冻存用的主要是Cryotop，商业化牛胚胎的大量冷冻使用的是OPS和SOPS，相对而言Cryotop有更高的成功率。但是这两种载体成本过高，限制了这项技术在畜牧业的推广应用。

目前商业化的冷冻载体成本高，购买途径少，货期长，不能反复使用，受载体的限制也没有办法储存大量的胚胎。同时，在猪囊胚的冻存和解冻中，传统方法，技术复杂，操作繁琐，需要工人熟练的掌握冷冻与解冻技术，而普通工人很难快速掌握冷冻技巧，细胞的冷冻、解冻存活率低，这就限制了此技术在的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，以解决以上缺陷。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，包括以下步骤：

S1：基于麦管制作的胚胎玻璃化冷冻Tip载体的制备

A1、将可控恒温热台、金属模块、紫外灯、麦管、眼科手术剪、订书机、订书针、格尺擦拭干净，并且用75％酒精对可控恒温热台、金属模块、眼科手术剪、订书机、订书针、格尺消毒后自然晾干；

A2、将可控恒温热台温度调节至50～60℃，待温度稳定后，操作人员带上防烫伤手套；

A3、使用格尺，在距离麦管开口端长1cm和2cm位置，以及在麦管开口处测量0.15cm宽度，分别进行简单标记；

A4、根据上一步标记，使用眼科手术剪剪开麦管，在麦管开口端剪留宽0.15cm、长1cm的塑料条；在可控恒温热台上，使用金属模块将除塑料条的其他部分麦管压平，并在上一步2cm标记位置使用订书机和订书针进行装订；

A5、将上一步制作好的麦管，在紫外灯下灭菌12～18min，并随机抽取两支灭菌后的麦管检验微滴立体性能，检验合格后，即完成了胚胎玻璃化冷冻Tip载体的制备；

S2：冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存

B1、将PN期猪孤雌胚胎显微操作去脂，并在PZM3中培养7天；