[发明专利]一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种用于质谱流式细胞仪检测的外泌体，其特征在于：包括能用于质谱流式检测的重金属标签化合物，所述重金属标签化合物分布在外泌体内腔中；所述重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式导入外泌体中；所述重金属标签化合物是指包含有原子量在75-209间的元素的化合物。

2.根据权利要求1所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体，其特征在于：所述重金属标签化合物可与细胞内蛋白、RNA、DNA中的至少一种相结合。

3.根据权利要求1所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体，其特征在于：所述重金属标签化合物为含有I¹²⁷的碘去氧尿啶或碘化丙啶，含有Rh¹⁰³或Ir¹⁹¹或Ir¹⁹³的DNA插入剂，含有Pt¹⁹⁴和Pt¹⁹⁵的顺铂中的至少一种。

4.权利要求1-3任一项所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

1)提取外泌体：通过梯度离心、浓缩，沉淀获取外泌体；或者通过超高速离心获得外泌体；

2)重金属标签导入：步骤1)获得的外泌体与重金属标签化合物通过电穿孔及孵育方式，将重金属标签化合物导入外泌体中；

3)获取具有重金属标签的外泌体：利用沉淀试剂盒或者超高速离心分离，去除没有被外泌体包裹的游离重金属标签化合物，获得用于质谱流式细胞仪检测的外泌体。

5.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述梯度离心、浓缩，沉淀获取外泌体，其具体制备方法的步骤如下：将细胞在培养基中有血清培养2天，用PBS洗3次，后用无血清培养1-2天；收集培养基的上清液，对上清液依次采用300g×5min、2000g×5min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片，再用0.22um滤膜去除凋亡小体，大囊泡，进一步使用100KD超滤管以1500g转速浓缩上清，去除大部分蛋白及小分子，沉淀试剂4℃过夜沉淀外泌体，1500g×30min去除上清，再次1500g×5min去除残余上清，PBS重悬后获得外泌体；

步骤1)中所述通过超高速离心获得外泌体，其具体制备方法的步骤如下：将细胞在培养基中有血清培养2天，用PBS洗3次，后用无血清培养2天；收集培养基的上清液，对上清液依次采用300g×5min、3000g×5min、10000g×30min离心去除培养液中的死细胞及细胞碎片以及大囊泡，而后通过100000g×70-90min得到含有外泌体的沉淀，PBS重悬后获得外泌体。

6.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述电穿孔及孵育的条件设置为：250V，100ms，6次，电穿孔后37℃孵育30min。

7.根据权利要求4所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述沉淀试剂盒为ExoQuick沉淀试剂盒；具体沉淀试剂的沉淀步骤如下：利用沉淀试剂对上述外泌体进行4℃过夜沉淀，1500g×30min,去除上清，再次1500g×5min,使用PBS重悬外泌体，10000g×5min离心，将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除，上清即为具有重金属标签化合物的外泌体；

步骤3)中所述超高速离心，具体步骤如下：外泌体进行100000g×70-90min离心得到含有外泌体的沉淀，PBS重悬后，再经过10000g×5min离心，将可能出现蛋白、外泌体或者药物的聚集体沉淀去除，上清即为具有重金属标签化合物的外泌体。

8.权利要求1-3任一项所述的用于质谱流式细胞仪检测的外泌体的应用，其特征在于：用于高通量的单细胞分析外泌体的摄取。