[发明专利]小鼠Tmem240重组真核表达质粒、慢病毒及构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及小鼠Tmem240重组真核表达质粒、慢病毒及构建方法。本发明重组真核表达质粒是将SEQ ID NO.1序列插入pEGFP‑N1载体的XhoI位点和EcoRI位点之间获得。慢病毒构建是以pEGFP‑T240‑N1质粒为模板，利用引物引物对1进行PCR扩增，合成含有APEX2的目的片段；对载体pLVX‑EGFP‑N1进行双酶切；对Tmem240片段进行双酶切；对含有APEX2目的片段进行双酶切；对酶切产物Tmem240片段，含有APEX2目的片段及载体pLVX‑EGFP‑N1回收、T4连接酶连接、感受态细胞转化，并进行菌落PCR验证；质粒提取，并测序，得到构建成功的pLVX‑T240‑APEX2‑EGFP，将其与psPAX2、pMD2.G质粒共同转染至293Ta细胞，并收集获得。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种小鼠Tmem240重组真核表达质粒、慢病毒及构建方法。

背景技术

TMEM家族中的一员TMEM240，是在脑和小脑中发现的编码含有跨膜结构域的蛋白质，目前为止，国内外对其细胞内定位、功能及其作用机制至今仍尚未报道。人类TMEM240位于1号染色体36.33处，基因序列长1128bp，含有4个外显子，编码

172个氨基酸的蛋白质，分子量22KD。小鼠Tmem240位于4号染色体，基因序列全长1378bp，含有4个外显子，编码172个氨基酸的蛋白质，分子量22KD。人源TMEM240和鼠源Tmem240蛋白质序列运用Pubmed的BLAST功能查询发现一致性达97.69％。通过TMHMM生物信息学软件分析Tmem240蛋白质氨基酸序列并进行生物信息学分析，发现Tmem240编码含有2个跨膜结构的跨膜蛋白，且具有一定的疏水特性。

TMEM240作为一个新发现的基因，其生物学功能是完全未知的，Pubmed上相关文献仅有一篇。文献报道，脊髓小脑共济失调21型，简称SCA21，它是常染色体显性遗传性神经退行性疾病，精神发育迟缓以及认知功能的严重障碍是其伴随症状，其特点是进行性的小脑共济失调，病变主要在脊髓和小脑。该文献明确报道常染色体显性遗传性神经退行性疾病SCA21型，该疾病致病的染色体位点位于1p36.33-p36.32；通过整个外显子组测序鉴定跨膜蛋白基因TMEM240中的致病突变(c.509C4T/p.P170L)，然后通过Sanger测序和共分离分析进行确认。常染色体显性SCA家族中新的致病基因，TMEM240，在8种不同的SCA21家族中具有各种错义突变(c.509C4T/p.P170L，c.239C4T/p.T80M，c.346C4T/p.R116C,c.445G4A/p.E149K,c.511C4T/p.R171W)和终止突变(c.489C4G/p.Y163*)，这些突变的频率是2％(8/368)；所有涉及到的氨基酸在进化过程中都是保守的(从斑马鱼到人类)。该文献表明，TMEM240是一个小的，高度保守的跨膜蛋白，在大脑中高表达，与已知的蛋白质没有同源性，能够引起常染色体显性遗传性神经退行性疾病SCA21型。

TMEM240编码的跨膜蛋白功能未知，作用机制仍是疑问，而基因的表达量与构建的表达质粒具有密切关系。为了进一步研究TMEM240编码的跨膜蛋白功能，我们需要构建一种可以高效表达TMEM240编码的跨膜蛋白的表达质粒。

发明内容

本发明通过构建pEGFP-Tmem240真核表达质粒，以及利用pEGFP-Tmem240真核表达质粒构建过表达Tmem240-APEX2的慢病毒，为探索Tmem240的功能提供基础。

本发明的第一个目的是提供一种小鼠Tmem240重组真核表达质粒，所述重组真核表达质粒是将如SEQ ID NO.1所示的序列插入pEGFP-N1载体的XhoI位点和EcoRI位点之间获得的。

本发明的第二个目的是提供一种上述重组真核表达质粒的构建方法，包括如下步骤：