[发明专利]一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法

权利要求书

1.一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)集成式纳米通道电极的制备和预处理

(1.1)制备集成式纳米通道电极

阳极氧化铝AAO纳米通道两端处喷涂金层，金层的一部分暴露作为电极，金层的另一部分作为导电部分，导电部分用绝缘物密封包裹并绝缘，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，从而形成集成式纳米通道电极INCE；

(1.2)集成式纳米通道电极的清洗和预处理

在集成式纳米通道电极INCE两端的金层处分别滴加10μL 0.5M H₂SO₄溶液，静置清洗15分钟，然后用H₂O彻底冲洗；然后在冲洗干净的集成式纳米通道电极INCE的两端处分别再滴加10μL 1mg/mL牛血清白蛋白BSA溶液，常温下封闭1小时，然后用H₂O彻底冲洗；

(2)磁性纳米粒子-抗体复合物制备

将羧基磁性纳米粒子用含吐温-20的2-(N-吗啉)乙磺酸磷酸盐缓冲液MEST清洗并离心3次，重悬在10mM N-羟基琥珀酰亚胺磺酸NHSS和15mM 1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐EDC的溶液中，含吐温-20的硼酸盐缓冲液BST清洗并离心3次，重悬在17μg/mL沙门氏菌抗体的含吐温-20的硼酸盐缓冲液BST溶液中反应2.5小时，加入10mg/mL牛血清白蛋白BSA溶液封闭1小时，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液PBST清洗三次并重悬，制备获得磁性纳米粒子-抗体复合物MNPs-Ab于4℃保存备用；

(3)细菌培养和平板计数

(3.1)培养沙门氏菌

取0.5mL沙门氏菌储备液于9mL脑心浸液培养基BHI中，放于37℃的摇床内培养过夜作为初始菌液，将初始菌液在沸水中灭活10分钟以彻底灭菌，PBS清洗三次并重新分散于PBS中，用无菌PBS溶液10倍稀释得到一系列稀释液，获得菌液，以供进一步使用；

(3.2)沙门氏菌平板计数

取10³CFU/mL含量的步骤(3.1)获得的菌液100μL铺盘于XLT4琼脂培养基中，37℃培养24小时后，对形成的菌落进行计数；

(4)电化学方法检测细菌

(4.1)将100μL的磁性纳米粒子-抗体复合物MNPs-Ab与1mL的步骤(3.1)获得的菌液混合，在常温下孵育45分钟；进行磁分离处理，然后用200μL的含吐温-20的磷酸盐缓冲液PBST清洗三次，最终重新分散于50μL的含吐温-20的磷酸盐缓冲液PBST中，得到细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物MNPs-Ab-St；

(4.2)将集成式纳米通道电极INCE夹在3D装置中，取10μL细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物MNPs-Ab-St注入3D装置中的集成式纳米通道电极INCE一侧之后，施加压力使溶液流经集成式纳米通道电极INCE至集成式纳米通道电极INCE的另一侧；

(4.3)用含吐温-20的磷酸盐缓冲液PBST代替复合物MNPs-Ab-St细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物溶液以步骤(4.2)同样的操作注入两次后，将10μL的K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆溶液分别注入3D装置中集成式纳米通道电极INCE的两侧表面，并进行电化学阻抗EIS测试，检测集成式纳米通道电极INCE两端电极的信号，经信号处理获得沙门氏菌的检测结果；

所述步骤(4)的3D装置包括夹片(1)、通孔(11)和O形橡胶圈(3)；两片夹片(1)相对布置，并且在两片夹片(1)相对表面的中心开设有环形凹槽，环形凹槽中均安装有O形橡胶圈(3)，两个O形橡胶圈(3)之间装夹集成式纳米通道电极(2)，集成式纳米通道电极(2)经导线(21)连接出，两片夹片(1)在环形凹槽中央处均开设有通孔(11)，溶液经一片夹片(1)的通孔(11)流入穿过一侧的O形橡胶圈(3)进入集成式纳米通道电极(2)，从集成式纳米通道电极(2)流出后穿过另一侧的O形橡胶圈(3)后，经另一片夹片(1)的通孔(11)流出。