[发明专利]间充质干细胞外泌组组合制剂及制备方法和应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：80-90份，中小分子量透明质酸钠：2-5份，黄芪提取物：3-5份、蕲艾提取物：1-5份，所述外泌组培养介质来源于人的脐带或脂肪；

所述黄芪提取物的有效组分为：黄芪苷I、黄芪苷II、黄芪苷IV、黄芪多糖I、黄芪多糖II和黄芪多糖III；

所述蕲艾提取物的有效组分为：桉油精、崖柏酮、樟脑、冰片、4-萜烯醇、1-石竹烯、4-甲基苄醇、黄酮、鞣酸和绿原酸。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，

所述的黄芪提取物是采用如下方法制备的：取黄芪加水煎煮煎液，滤过，滤液浓缩，加乙醇静置，取上清液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成细粉，即得所述的黄芪提取物。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，

所述蕲艾提取物是采用如下方法制备的：取艾叶，加入所述艾叶重量10-20％的醋，于170-270℃下炒20-30min后，干燥粉碎，所得粉碎料中加入质量浓度30-50％的乙醇溶液，所述粉碎料与乙醇溶液的料液比为1g∶10-30mL，回流条件下萃取1-5h，过滤，滤液浓缩，得所述蕲艾提取物。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，按重量份数计，包括：人间充质干细胞外泌组培养介质：90份，中小分子量透明质酸钠：0.5份，黄芪提取物：5份、蕲艾提取物：4.5份，所述人间充质干细胞来源于人的脐带或脂肪。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，所述的中小分子量透明质酸钠分子量为200kda-400kda。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌组组合制剂，其特征在于，

所述人间充质干细胞外泌组培养介质是通过以下方法制备的：

(1)间充质干细胞分离培养：在4℃条件下将脐带装于50mL离心管，经第一PBS保护液清洗3遍，所述的第一PBS保护液中庆大霉素终浓度为25ug/mL，再用第二PBS保护液清洗2遍，去除两端各0.5em长的脐带，将其余脐带剪成2cm长小段，装于50mL离心管中，添加所述的第二PBS保护液，清洗至上清无血色；

所述的第一PBSPBS保护液包括如下组分：

NaCl：8.0mg/mL，KCl：200ug/mL，Na₂HPO₄·H₂O：1.56mg/mL，KH₂PO₄：200ug/mL，庆大霉素：25ug/mL，PH值为7.2；

所述的第二PBSPBS保护液包括如下组分：

NaCl：8.0mg/mL，KCl：200ug/mL，Na₂HPO₄·H₂O：1.56mg/mL，KH₂PO₄：200ug/mL，PH值为7.2；

沿静脉内腔纵向剪开清洗后的脐带，剥离静脉内膜，继而将覆盖动脉的华通氏胶表面略微撕开，而后抽出两根动脉，将华通氏胶撕下，去除脐带外皮；用手术剪或手术刀将华通氏胶剪切成边长3-5mm左右的小块，并加入100mm皿中，超净台内静置15分钟，组织块贴壁后，添加完全培养基，使得皿中含有10mL培养基，轻轻摇晃均匀，盖上盖子放入培养箱；每隔3天换液，7-14天陆续有间充质干细胞爬出；

(2)收集间充质干细胞：PBS漂洗爬出间充质干细胞1遍，采用消化酶消化细胞1-2分钟，加入4倍消化酶体积培养基终止消化，800g离心5分钟，吸弃上清，用培养基重悬细胞，收集细胞种到细胞瓶中；细胞计数，细胞种植密度：8000个/平方厘米；细胞传代培养，3天传代一次；

(3)外泌组培养介质收集：选取细胞状态较好的2-5代间充质干细胞培养48h后，富集培养上清于50ml离心管中，1000g离心10分钟，去除细胞碎片及杂蛋白，弃掉沉淀，将上清液置于4度冰箱备用；所述的消化酶包括胶原酶、透明质酸酶和胰酶。