[发明专利]一种好养反硝化细菌筛选引物及方法

权利要求书

1.一种用于好养反硝化细菌筛选的LAMP扩增引物，其特征在于所述的引物序列如下表1：

表1 引物序列

2.利用权利要求1所述引物进行好养反硝化细菌的筛选方法，其特征在于所述方法具体步骤如下：

(1)菌株富集培养:

无菌条件下取含有菌体的水样的按照体积比1:9接入到灭菌的生理盐水中，恒温振荡；

取振荡液接种于液体富集培养基中，于28℃、好氧条件下振荡培养5d，重复转接3～4次后，取富集液进行系列梯度稀释，取适当倍数稀释液涂布于分离培养基上，放于28℃恒温培养箱，培养48～72h，根据菌落特征挑选不同形态的单菌落进行平板划线分离，重复划线分离4～5次，直至得到纯的单菌落，作为候选菌株；

(2)LAMP初次筛选：提取候选菌株的DNA，以提取的DNA为模板，分别利用表1nirS、nirK和nosZ基因的引物进行LAMP扩增反应，扩增反应体系如下：10×等温扩增反应缓冲液2.5μL、100mM的MgSO₄溶液1.5μL、10mM dNTP Mix3.5μL、25×FIP/BIP Primers1μL、25×F3/B3Primers1μL、8000 U/ml Bst 2.0 DNA聚合酶1μL、DNA Sample 1μL、灭菌水补充至25μL；10×GeneFinder^TM核酸染料4μL点在离心管盒盖内侧，反应温度60℃，反应时间60min；检测过程中以特定的反硝化标准菌株作为阳性对照，以ddH₂O代替菌株作为阴性对照；

LAMP扩增产物的检测，将预先点于离心管盖内侧的染料弹下，直接肉眼观察，反应液变为绿色的阳性，选取LAMP反应中nirS或nirK基因为阳性、同时nosZ基因也为阳性的菌株作为初筛菌株，进行后续筛选；

(3)PCR二次筛选：提取初筛菌株的DNA，以提取的DNA为模板，利用nosZ引物进行PCR扩增反应，nosZ引物的序列为nosZ-F：5'-cgytgttcmtcgacagccag-3'，nosZ-1622R5'-cgcrasggcaasaaggtscg-3'；反应体系为：Premix LA Tap 25μL、25×Primers0.4μL、模板2μL、ddH₂O补充至50μL；PCR程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30S，55℃退火30S：72℃延伸30S；循环30次，最后72℃延伸5min，4℃保存；PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像系统观察拍照；选择nirS或nirK基因为阳性、同时nosZ基因也为阳性的菌株为阳性的菌株，进行下一步筛选；

(4)产气检测三次筛选：将步骤(3)的阳性菌株接种到产气测试培养基中，然后将锥形瓶放进密闭的数字式压差仪气罐中，28℃，振荡培养24h以上，选择有气体产生的菌株即好养反硝化细菌。