[发明专利]一种基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法

权利要求书

1.一种基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法采用3D纳米步行机对miRNA141进行识别及剪切扩增，结合磁珠与剪切酶循环技术释放银纳米粒子；通过酸将纳米粒子转换为离子，与光电材料CdSe进行阳离子交换，使CdSe光电信号降低，实现对miRNA141的检测；

所述基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法包括以下步骤：

第一步，制备3D纳米步行机；将10μL 1.0×10^-6mol/L的Walking DNA与同浓度的Protecting DNA在37℃水浴中杂交互补，取互补好的Walking DNA和10μL 1.0×10^-5mol/LSupport DNA分别用TCEP活化巯基1h；将活化好的Walking DNA与Support DNA一起加入到1mL粒径为20nM的AuNPs中混匀，与摇床中过夜，离心洗涤3次后，重新分散到100μL pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到3D纳米步行机；

所述20nM AuNPs金纳米粒子的制备，向已泡过王水的圆底烧瓶中加入100mL 1.0×10^-3mol·L^-1的氯金酸，加热搅拌至溶液回流；反应后，将10mL 3.9×10^-4mol·L^-1的柠檬酸钠在搅拌的同时快速准确的加入到圆底烧瓶中，继续加热回流；溶液的颜色随即发生改变，由最初的淡黄色逐步变为深红色，继续回流15min后关掉加热，将反应体系自然冷却至室温后停止搅拌，得到粒径为20nM的球形金纳米粒子；

第二步，制备DNA探针，修饰有磁珠的Probe 1 DNA与修饰有AgNPs的Probe 2 DNA杂交互补；

所述探针的制备包括：将10μL 1.0×10^-5mol/L Probe 1 DNA用EDC和NHS溶液活化羧基，将活化后的Probe 1 DNA与100μL氨基修饰的磁珠混合，磁力离心洗涤，重新分散到100μLPBS中，得到修饰有磁珠的Probe 1 DNA；

另将10μL 1.0×10^-5mol/L Probe 2 DNA加入1mL的AgNPs银纳米颗粒溶液中，放入摇床至少摇18h后，加入122μL 0.01mol/LPBS调节pH和离子强度，继续摇6h；之后每隔3h，向溶液中加入21μL2.0mol/L的NaCl溶液，最后再摇48h；离心洗涤，重新分散到100μL得到修饰有AgNPs的Probe 2 DNA；

分别取10μL修饰有磁珠的Probe 1 DNA与修饰有AgNPs的Probe 2 DNA杂交互补，备用；第三步，制备CdSe量子点并修饰到已经修饰了一层TiO₂的ITO电极上，检测电流信号；

第四步，将检测物质与第一步制备的3D纳米步行机共同孵育2h后，离心取上清液再与第二步的产物共同孵育，磁分离取上清液；

第五步，将第四步的上清液加入硝酸溶解后滴加到第三步的电极上进行阳离子交换，检测光电流信号；测得的光电流信号与第三步测得的光电流信号的差值与检测物质浓度相关；具体包括：在0.6mL的离心管中加入10μL1.0×10^-12mol/L的miRNA141，再加入10μL制备好的3D纳米步行机和2μLNt.BsmAI剪切酶；加0.01mol/LPBS定容成50μL，在37℃水浴锅中孵育2h；miRNA141与Protecting DNA结合后，Walking DNA暴露出与Support DNA互补的序列；Walking DNA与Support DNA互补后形成Nt.BsmAI剪切酶的剪切位点，在Support DNA上剪下一段DNA后，Walking DNA再与其他Support DNA结合剪切；

离心取上清液加入Probe 1 DNA与Probe 2 DNA杂交互补的结构中，加入1μLT7剪切酶，孵育2h；Nt.BsmAI剪切酶剪切下来的DNA片段与Probe 1 DNA和Probe 2 DNA杂交互补的结构结合，暴露出T7剪切酶剪切的5’端的凹末端，使得AgNPs游离到溶液中；

磁力分离后，取上清液加入10μL1.0mmol/L硝酸酸解AgNPs，10min后得到Ag⁺；将酸解后的溶液滴到上述制备好的ITO电极上，反应10min，进行阳离子交换，对阳离子交换后的ITO电极进行光电流检测；

检测池采用ITO电极，铂丝电极，银/氯化银电极构成的三电极系统，取0.1056g抗坏血酸溶于6mL PBS作为电解液，检测光电流信号。