[发明专利]一种生物酶法生产异戊二烯的方法

说明书

本发明提供一种蒲公英IspS基因，以及通过将该基因构建重组载体并导入毕赤酵母中，所得到的重组毕赤酵母可以高效的表达IspS基因，进而高效催化生产异戊二烯，比现有技术的异戊二烯产量有显著提高。

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体涉及一种生物酶法生产异戊二烯的方法。

背景技术

异戊二烯(Isoprene)，学名为2-甲基-1,3-丁二烯，其分子式是C₅H₈，是一种没有颜色、有刺激性气味、易挥发的油状液体。异戊二烯可在空气或者氧气中燃烧，能与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限＞1.6％。其结构中有共价双键，因此化学性质活泼，能与多种物质发生氧化、加成以及聚合反应，易发生均聚反应和共聚反应，是重要的平台化工原料。我国对于异戊二烯的应用主要集中在橡胶行业和精细化工行业。其中，在橡胶行业的应用占90％。另外，异戊二烯在农药、医药、香料及粘合剂的制造方面也有广泛应用。

由于异戊二烯用途广泛，对于异戊二烯的需求量也因此增大。目前，工业生产异戊二烯的方法可以归为3类：C5馏分分离法、化学合成法、脱氢法。目前工业上异戊二烯的生产方法都存在诸多弊端。主要集中在工艺流程长，设备要求高，产品产率低、纯度低，以及对环境造成污染等方面。并且这些方法的原料多来自石油裂解C₅馏分，石油资源日益枯竭必将对异戊二烯的生产造成影响。因此，为了环境保护以及石油资源合理利用，寻求一种绿色有效的异戊二烯生产途径势在必行。

自然界中许多生物都具有产异戊二烯的能力，比如白杨、柳树、松柏等绿色植物以及一些真菌、细菌等微生物。异戊二烯类化合物在植物体内发挥着重要作用，作为初级代谢产物，异戊二烯类化合物可以维持细胞膜流动性，协助电子运输，参与呼吸作用以及光合作用，调节生长发育；作为刺激代谢产物可以作为信号参与抵御环境、害虫等的威胁。但是，植物生产的异戊二烯非常少并且收集困难，因此，想要依靠大自然中的植物大量生产异戊二烯较为困难。与植物相不同，微生物具有个体小、繁殖快，并且生长不受自然环境影响等优点，更适合用于异戊二烯的大规模生产。目前，用于生物法合成异戊二烯的微生物主要主要有酵母菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等，其中大肠杆菌遗传背景比较清晰，受体系统完备，适合外源基因的导入和表达。2012年，日本两家公司计划共同开发异戊二烯生物合成工艺。国内研究生物合成异戊二烯的起步较晚，目前仍然处在实验室的研究阶段，选择合适的原料，提高异戊二烯转化率，建立有效的异戊二烯分离体系都是需要进一步研究的方面。生物体内合成异戊二烯前体物质异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)的代谢途径有两种，即2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径和甲羟戊酸途径(MEP途径和MVA途径)。

体外多酶催化体系在异戊二烯的生产上也有应用。Tyler P.Korman等构建了一条无细胞多酶催化生产异戊二烯的途径，该途径包含12个酶，糖酵解途径为MVA途径提供足够的ATP，同时提供NADPH和乙酰辅酶A，异戊二烯摩尔产率接近100％。因此，通过将异戊二烯途径插入到糖酵解途径中，可能在体外从葡萄糖生产异戊二烯及其它乙酰辅酶A衍生的类异戊二烯化合物。

CN103789293B公开了利用蓝藻生产异戊二烯的方法，包括：包含异戊二烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶的融合蛋白。本发明对蓝藻进行遗传改造，在蓝藻中表达植物来源的异戊二烯合成酶(IspS)，通过多种方法显著地提高了基因工程蓝藻生产异戊二烯的产量。

CN103233044B一种异戊二烯的生产方法，并提供了一种用于生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2013167。本发明通过将来自葛藤(Puerariamontana var.lobata)的异戊二烯合成酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到能重组表达异戊二烯合成酶，进而高效发酵生产异戊二烯的毕赤酵母工程菌株，可广泛应用于异戊二烯的生产。

从以上结果可以看出，采用微生物进行异戊二烯的生产已经是工业化可以实现的事情。但是其产量低，还有进步的空间。