[发明专利]具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株、筛选方法、重组工程菌表达重组蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株、筛选方法、重组工程菌表达重组蛋白的制备方法，属于大肠杆菌菌株技术领域，筛选方法包括以下步骤：诱变过程、加压培养过程以及传代稳定性检测过程，诱变过程、加压培养过程以及传代稳定性检测过程形成一次完整的筛选过程，重复N次筛选过程得到纯化的具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株；其中：N为自然数，第N次筛选过程中被诱变的菌株为第N+1具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株且加压培养的噬菌体为第N+1噬菌体；该具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株N+1种噬菌体均具有抗性，不受这N+1种噬菌体的影响，因此不需要定期对设备、环境消毒或更换不同的大肠杆菌宿主，节约生产成本和提高了生产效率。

技术领域

本发明属于大肠杆菌菌株技术领域，具体涉及一种具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株，具有抗性的大肠杆菌菌株的筛选方法以及其在形成重组工程菌种中的应用。

背景技术

自然界中，细菌培养物易受各种噬菌体的感染。特定的噬菌体会感染特定的细菌培养物，导致此培养物的完全裂解。在实验室研究阶段，细菌培养物相对规模较小，感染噬菌体后细菌培养物的处理较为容易，也较好完全清除这些噬菌体感染。近几十年来，基因工程领域技术的飞速发展，某些细菌已经被驯化并广泛用于发酵过程。通过大规模培养细菌从而生产大量的生物活性重组多肽或重组蛋白已经是非常广泛，而这类产品的大规模生产通常需要发酵大量的基因工程细菌，特别是高细胞密度发酵技术的广泛应用，使得基因工程细菌的用量和密度更大。由于每天在庞大的发酵设备中培养大量细菌，因此，大多数发酵工业中，遭遇噬菌体污染问题已经屡见不鲜。

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是用于表达重组多肽或蛋白的常用宿主。目前，为了预防噬菌体污染问题，工业生产中通常定期对设备或环境消毒，或是更换不同的大肠杆菌宿主。然而，这并不能很好地解决噬菌体污染问题，噬菌体污染现象仍然频频出现。因此，筛选具有抗噬菌体能力的大肠杆菌菌株可以从根本上有效解决噬菌体污染问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的工业生产中通常定期对设备或环境消毒，或是更换不同的大肠杆菌宿主。然而，这并不能很好地解决噬菌体污染问题，噬菌体污染现象仍然频频出现的问题，本发明提供了一种具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株。

本发明所采用的技术方案为：一种具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：

S1：将对所有噬菌体均无抗性的大肠杆菌经过化学诱变或物理诱变，得到诱变大肠杆菌菌落；

S2：将诱变大肠杆菌菌落与第一噬菌体混合加压培养，筛选出形态完整的诱变大肠杆菌菌株即为具有第一噬菌体抗性的大肠杆菌菌株；

S3：步骤S1和步骤S2形成一个诱变筛选过程，重复诱变筛选过程1-2次，得到第一具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株；

S4：传代稳定性检测，具体为：步骤S3得到的具有第一噬菌体抗性的纯化大肠杆菌连续传代10代，每传代1次，用双层平板法测定其噬菌体抗性，得到纯化的第一具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株；

S5：步骤S1、S2、S3以及S4构成一次完整的筛选过程，重复N次筛选过程得到纯化的具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株；其中：N为自然数，第N次筛选过程中被诱变的菌株为第N+1具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株且加压培养的噬菌体为第N+1噬菌体。

本发明的有益效果为：该具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株N+1种噬菌体均具有抗性，不受这N+1种噬菌体的影响，因此不需要定期对设备、环境消毒或是更换不同的大肠杆菌宿主，大大节约了生产成本和提高了生产效率。

具有噬菌体抗性的大肠杆菌菌株具有抗性性能稳定、生长速度以及遗传性好，与其结合形成重组菌株中的质粒基因的表达没有任何的影响，因此可普遍应用于重组多肽或蛋白类产品的生产。