[发明专利]一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽T9W的方法

说明书

本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法。编码抗菌肽T9W的DNA序列，如SEQ ID No.1所示，并将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA‑T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10。用电转化方法将质粒转入到毕赤酵母菌X‑33感受态细胞中，阳性转化子在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。为进一步扩大发酵提供理论依据。本专利选用毕赤酵母作为抗菌肽T9W的表达宿主，完成了T9W的体外表达，本发明有效降低了抗菌肽T9W的生产成本，表达量高达13mg/L，实现了抗菌肽T9W的高效表达，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题。

技术领域

本发明涉及一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法。

背景技术

广谱抗生素的大量使用不仅导致了耐药菌在世界范围内频繁出现，而且其在清除病原菌的同时也杀灭了正常细菌，对机体微生态平衡造成了严重破坏，在临床上经常出现继发感染等负面后果。抗菌肽以其卓越的抗菌活性及独特的作用机制而倍受青睐。抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)，又称为宿主防御肽(Host Defense Peptide，HDP)，是机体先天免疫系统的重要组成部分，是保护宿主抵御外源病菌侵入的屏障。抗菌肽来源广泛，具有调节免疫，广谱杀灭细菌、真菌、病毒、寄生虫、癌细胞等多方面的生物学功能。此外，抗菌肽特殊的作用机制成为新一代抗菌药物的潜质。新型高效抗菌肽T9W,其氨基酸序列RFRRLRKKWRKRLKKI，是一种能够靶向杀灭绿脓杆菌(P.aeruginosa)且无细胞毒性的α-螺旋抗菌肽，具有开发为新型饲料添加剂的潜力。但高昂的合成费用限制了T9W的进一步研究以及实际应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法，实现抗菌肽T9W高效分泌表达。

本发明所采用的技术如下：一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法，如下：根据毕赤酵母的密码子偏爱性对抗菌肽T9W的氨基酸序列进行人工设计编码，编码抗菌肽T9W的DNA序列，如SEQ ID No.1所示，并在其5’端连接限制性核酸内切酶XbaI酶切位点和Kex2信号肽切割位点，3’端连接两个终止密码子TAA，在基因片段终端连接限制性核酸内切酶XhoI酶切位点，将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA-T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10，利用电转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌毕赤酵母菌X-33中，在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。

本发明还提供上述毕赤酵母X-33基因工程菌分泌的重组蛋白的纯化方法，其包括对发酵液进行凝胶过滤层析、离子交换柱层析和RP-HPLC的步骤。

本发明有效降低了抗菌肽T9W的生产成本，表达量高达13mg/L，实现了抗菌肽T9W的高效表达，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景，为后续T9W的研究提供了理论依据和基础。

附图说明

图1为重组表达载体构建测序电泳图；

图2为测序图与合成基因对比结果图；

图3为重组表达载体酶切鉴定结果图，M：5000bp DNA marker；1：表达载体pPICZαA-T9W；2：pPICZαA-T9W线性化产物；

图4为48孔板发酵表达上清的抑菌圈结果图，方形板的抑菌孔对应48孔板的单孔发酵液上清；对照板每孔加入等量BMGY，AB板每孔分别对应为所挑72个单菌落；

图5为Tricine-SDS-PAGE检测结果图，M：超低分子量蛋白Marker(2μL)；48-120：分别表示摇瓶表达T9W 48h-120h的发酵上清(20μL)；