[发明专利]识别草鱼出血病病毒的核酸适配体及其构建方法和应用

说明书

一种核酸适配体，包括如下核苷酸序列：TGAACCCACCTCAGGGCATCTTACATTTCTTCTAAGTTGTTACCATGTTT。本发明提供的核酸适配体的分子量较小，制备周期短，重现性好，便于体外化学合成，便于标记，序列稳定易于运输和保存。该核酸适配体对草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒具有较高的特异性和亲和力，并且无免疫原性。

技术领域

本发明属于水产病原菌检测技术领域，具体地，涉及识别草鱼出血病病毒的核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术

广西是我国的水产养殖大省，主要养殖品种包括草鱼、斑点叉尾鮰、石斑鱼、草鱼、对虾、牡蛎、马氏珠母贝和各种食用植物。据统计，截止2017年底，广西的渔业经济总产值已超过621亿元，水产养殖总量超过320.76万吨。然而，水产养殖规模的不断扩大和养殖密度的持续增加导致养殖环境恶化，各类水产疫病病原频繁暴发。2018年广西南宁、河池、柳州等地池塘和网箱养殖的草鱼暴发疑似草鱼出血症，通过对患病草鱼中病原微生物进行聚合酶链式反应检测技术(polymerase chain reation,PCR)分析鉴定，证明草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒(Grass carp reovirus,GCRVⅠ)是主要致病病原。草鱼出血症是草鱼养殖中最常见的病毒病，其致病病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)，又称为草鱼出血病病毒(GCHV)，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属。GCRV病毒作为一种高致病性鱼类传染病毒，通常表现为爆发式感染，即会在极短时间内导致鱼大量死亡。目前GCRV病毒引起的草鱼病毒性出血症在我国广泛存在，严重影响我国的水产养殖业的发展。因此，研发新型高效的抗病毒药物，同时，针对GCRV病毒发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的检测技术，对于防控草鱼GCRV病毒的危害来说至关重要。

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment technology,SELEX)，在体外经过多轮筛选获得的、能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体具有特异性高、亲和性高、稳定性强、易化学合成和化学修饰等诸多优点。目前核酸适配体作为一类新型的、广受关注的新型检测和治疗工具，在人类医学研究、疾病诊断、病毒侵染机制研究等领域展现出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种识别草鱼出血病病毒的核酸适配体及其构建方法和应用，以实现草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的高灵敏、特异性检测。

根据本发明的一个方面，提供一种识别草鱼出血病病毒的核酸适配体：包括SEQID NO.1的核苷酸序列。

优选地，包括SEQ ID NO.2的核苷酸序列。

优选地，其核苷酸序列上的至少一个核苷酸被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，其核苷酸序列上结合有标志物，标志物选自荧光物质、发光材料、生物素或酶中的一种或一种以上。

优选地，荧光物质选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的一种或一种以上。

根据本发明的另一个方面，提供一种构建上述识别草鱼出血病病毒的核酸适配体的方法，采用SELEX技术，包括以下步骤：(1)建立单链DNA随机文库Library50，单链DNA随机文库Library50的核苷酸序列为：

5’-GTCTGAAGTAGACGCAGGAG(50N)AGTCACACCTGAGTAAGCGT；

(2)利用草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒感染细胞筛选单链DNA随机文库Library50，得出草鱼呼肠孤Ⅰ型病毒的特异性DNA文库；(3)以特异性DNA文库作为模板，与核苷酸序列为SEQ IDNO.3的引物、核苷酸序列为SEQ ID NO.4的引物进行PCR扩增。