[发明专利]一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法

说明书

本发明公开了一种同位素稀释质谱法测定血清miR‑224含量的方法，包括如下步骤：(1)合成miR‑224核酸单链并配成溶液，建立标准曲线；(2)合成核酸肽探针并配成溶液，用以捕获miR‑224；(3)合成同位素标记的多肽并配成溶液作为内标；(4)在血清样本中提取miRNA；(5)将提取出的miRNA生物素化；(6)将上述miRNA与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物；(7)加入核酸肽探针捕获miR‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物；(8)将上述复合物清洗干净后加入胰蛋白酶酶解，然后将酶解产物固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶；(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析；(10)计算血清样本中miR‑224含量。本发明准确度高，结果可靠。

技术领域

本发明涉及一种测定血清miR-224含量的方法，尤其涉及一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法。

背景技术

研究表明，miR-224是肿瘤相关的一个miRNA分子，在多种恶性肿瘤组织(如胃癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌)中呈现高表达。目前，miR-224的定量检测方法分间接法和直接法，其中间接法包括聚合酶链反应法、荧光共振能量转移法、基因芯片法、电化学催化法、下一代测序法、电化学法等。直接法包括双重特异性核酸酶辅助光谱检测法、微分干涉对比显微镜成像法、毛细管电泳法等。间接法通常需要首先对miR-224进行扩增或用化学试剂和酶进行修饰，然后进行凝胶成像或荧光素标记，需要耗费大量的时间和人力成本，而且结果易受各种因素的影响。上述miR-224直接法虽然一定程度上解决了间接法缺陷，但定量结果准确性较差。

同位素稀释质谱法是一种新的miR-224直接定量检测法，是目前公认的化合物准确定量的权威方法。该法利用质谱测定加入了同位素标记的待测物样品中标记与非标记待测物峰面积或峰高比值来推算待测物在样品中浓度。该法特异性高、灵敏度高、定量结果准确可靠、具有较宽的动态测量范围且定量结果具有较高的溯源性等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠的miR-224含量测定的方法，本发明方法可以对血清样品中miR-224含量直接进行测定。

一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，包括如下步骤：

(1)将合成的miR-224核酸单链配成溶液，用于建立标准曲线；

(2)合成核酸肽探针配成溶液，用以捕获miR-224；

(3)将合成的同位素标记多肽并配成溶液作为内标；

(4)在血清样本中提取miRNA；

(5)将提取出来的miRNA进行生物素化；

(6)将上述生物素化的miRNA与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

(7)加入核酸肽探针捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

(8)将核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物清洗干净后加入胰蛋白酶进行酶解，然后将酶解产物进行固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶；

(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析；

(10)计算血清样品中miR-224含量。