[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为以下任意一种：

purD P116L点突变的枯草芽孢杆菌；

purR A65D点突变的枯草芽孢杆菌；

guaB G279R点突变的枯草芽孢杆菌；

purD P116L和purR A65D点突变的枯草芽孢杆菌；

purD P116L、purR A65D及guaB G279R点突变的枯草芽孢杆菌；

其中，点突变前的菌株为工程菌B.subtilis 168。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括：

步骤A、采用基因无痕编辑法构建枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株；

步骤B、分别制备purD P116L 、purR A65D 、guaB G279R 三个点突变基因片段，与载体连接分别获得三个单一位点突变质粒；

步骤C、三个单一点突变质粒分别或依次转化枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株获得单一位点突变的枯草芽孢杆菌或多个位点突变的枯草芽孢杆菌；

所述枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株为B.subtilis 168菌株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤A所述构建枯草芽孢杆菌(Δupp)菌株的方法具体为用引物upp-1f/1r、upp-2f/2r，以B.subtilis168基因组为模板，使用pfuDNA聚合酶扩增分别得到888bp和938bp的上下游同源臂；用引物upp-1f/2r扩增得到上下游融合片段，将片段与载体质粒连接通过Spizizen转化至B.subtilis168菌株筛选获得B.subtilis168(Δupp)菌株；

其中，所述upp-1f的序列如SEQ ID No.1所示；所述upp-1r的序列如SEQ ID No.2所示；所述upp-2f的序列如SEQ ID No.3所示；所述upp-2r的序列如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述筛选具体为用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选转化子，将获得的转化子接到LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含5μg/mL的氯霉素LB平板获得一次重组子；将一次重组子接到LB液体中，42℃、200rpm培养12h并传一代，稀释涂布含0.8μM5-FU的LB平板筛选二次重组子即B.subtilis168(Δupp)菌株。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，步骤B所述载体为pKSU。

6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在发酵生产腺苷中的应用。

7.一种腺苷的生产方法，其特征在于，将权利要求1所述枯草芽孢杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。

8.根据权利要求7所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH7.0～7.2；

所述发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH7.0～7.2；

所述发酵条件为36℃，发酵48h。