[发明专利]用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法

说明书

本发明公开了一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，先对受到污染的豆瓣样品进行菌株分离，然后提取DNA，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将细菌16SrRNA转化到大肠杆菌感受态细胞培养，采用菌落PCR法获得阳性克隆子，提取质粒，测序，在GenBank数据库做相似性分析，确定菌株的分类学地位，确定毒力致病因子基因，设计引物，先优化单重LAMP反应体系，再优化反应温度，引物浓度和Mg²⁺浓度，获得二重LAMP反应体系，检测二重LAMP反应体系的特异性和灵敏性，然后将其运用到受污染豆瓣的菌株筛查中。本发明用二重LAMP进行快速、准确鉴定分离的调味品致病菌，可以对调味品中的致病菌进行控制和预防。

技术领域

本发明涉及一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，更具体地，本 发明涉及一种郫县豆瓣的致病微生物二重LAMP快速筛查技术。

背景技术

环介导等温扩增(LAMP)技术是日本学者2000年发明的一种新型的恒温核 酸扩增技术，因其独特的核酸反应机理，产物在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出其 典型的阶梯状条带，结果鉴定方便快捷，非常适合食源性致病菌的快速检测。 LAMP技术以特有的灵敏、快速、特异等优势，现已被逐渐应用于病原微生物的 检测如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。Kayo-ko Ohtsuka 等(2010)抽样检测了110个可能被沙门氏菌感染的水样调味品，使用LAMP技 术对沙门氏菌的检出率为100％。李玉峰等(2011)选用了不耐热肠毒素基因设 计出LAMP引物，优化了LAMP的反应条件，并且考察了方法的特异性和灵敏性。 相关报道均未研究调味品中的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，且采用LAMP检 测法均为单重，检测效率较低。

发明内容

为了解决现有LAMP检测法检测效率低，不利于对调味品中的污染微生物进 行检测的问题，本发明提供了以下技术方案：

一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，包括如下步骤：

(1)菌株分离

将豆瓣样品梯度稀释后涂布在平板培养基上，培养获得单个菌落，挑取菌 落并利用生理盐水制成菌液；

(2)基因组DNA提取及未知菌鉴定

①细菌DNA的提取

使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，在1％的琼脂糖 凝胶电泳检测所提取菌株的DNA；

②未知菌株的PCR扩增

上引物：Eu27F，10μmol·L^-1；下引物：1490R，10μmol·L^-1；以提取到 的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：dd water 16μL、冰上解冻的10×Taq 缓冲液2μL、冰上解冻的dNTP 2μL、25mmol·L^-1的MgCl₂1.5μL、上下引物 和模板各1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR条件：95℃预热5min，95℃变 性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min；

③重组质粒构建及16SrRNA鉴定

对细菌16SrRNA基因与p GEM-T easy进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞，过夜培养，采用菌落PCR方法挑选阳性克隆子，选择鉴定为阳性 的克隆子扩培，提取质粒，酶切、测序鉴定；测序结果通过16SrRNA序列校对 后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度为99％的菌株，确定 菌株的分类学地位，进行编号；

(3)二重LAMP鉴定致病菌

①LAMP引物设计