[发明专利]一种耐热乙酰乳酸异构还原酶

说明书

本发明涉及一种耐热乙酰乳酸异构还原酶。本发明还涉及编码该酶的多肽序列；以及该耐热乙酰乳酸异构还原酶的制备方法。

技术领域

本发明涉及一种耐热乙酰乳酸异构还原酶，该酶主要应用于生物化工领域，例如燃料乙醇或者异丁醇的生产。本发明还涉及编码该酶的多肽序列；以及该耐热乙酰乳酸异构还原酶的制备方法。

背景技术

酶是一类生物大分子催化剂，相比普通的化学催化剂作为生物催化剂的酶有着很多的突出优势：1.绿色环保：酶的催化反应条件非常温和，一般为常温常压，并且pH也在中性附近不会是极端酸性或碱性，也不需要重金属或者有机溶剂参与，无废水废气等污染物产生，由于酶本身主要是蛋白质，因此也不具备污染性。2.催化效率高：一般来说酶的催化效率比普通化学催化剂高出3到6个数量级。3.专一性好：酶的活性中心有着特殊的构型，底物只有与之匹配才能被催化，由于酶本身是手性分子，酶在催化过程中具有良好的手性选择性。

乙酰乳酸异构还原酶是支链氨基酸合成途径中的第二个酶，可将2-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基-3-异戊酸（缬氨酸和亮氨酸的前体）或2-乙酰-2-羟基丁酸酯转化为2,3-二羟基-3-甲基戊酸（异亮氨酸的前体），该转化过程非常特殊，通过一个活性中心完成两步反应，首先底物发生异构化反应，然后再被NADPH或者NADH还原后得到最终产物。由于乙酰乳酸异构还原酶特殊的催化特性，它在生物化工中有着重要的潜在应用，例如它是无细胞体系下生产乙醇或异丁醇过程中的关键酶之一。

乙酰乳酸异构还原酶可被分成两大类： I类为较短的乙酰乳酸异构还原酶，长度为~330个氨基酸，含有具有Rossmann折叠的氮端结构域和以α螺旋为主的碳端结构域，I类KARI需要来自相邻亚基的碳端结构域形成二聚体以完成活性位点。因此它们通常以二聚体的形式存在，但是它们还可以进一步组合成12聚体。例如结核分枝杆菌乙酰乳酸异构还原酶为二聚体，而铜绿假单胞菌乙酰乳酸异构还原酶为12聚体。II类乙酰乳酸异构还原酶，的氨基酸残基序列较长，大约为500个氨基酸，典型的代表有：大肠杆菌乙酰乳酸异构还原酶和植物中的乙酰乳酸异构还原酶，II类乙酰乳酸异构还原酶可以形成独立的活性中心，II乙酰乳酸异构还原酶一般以二聚体或四聚体的形式存在。

在工业过程酶作为催化剂的主要缺点之一是它们的半衰期较短且热稳定性较低，因此通过在自然界中寻找或者通过改造获得耐热的酶是酶工程领域的重要研究方向，耐热的酶不但半衰期长，而且可以让反应在较高温度下进行，从而加快反应速率。乙酰乳酸异构还原酶在生物化工领域有着重要的潜在应用价值，因此寻找耐热的乙酰乳酸异构还原酶在生物化工领域是有着重要需求的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列，该序列具有乙酰乳酸异构还原酶的活性。

一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶与SEQ ID NO:1 至少有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。

另一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶具有良好的热稳定性，在高温反应体系中展示良好的催化活性。其中所述高温为50℃以上，例如60℃、65℃、70℃、75℃。

另一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶是通过原核表达系统进行表达的，例如大肠杆菌表达系统。

另一方面，所述乙酰乳酸异构还原酶是通过在酶的氮端或碳端引入组氨酸标签，通过金属离子螯合色谱纯化，然后再通过分子排阻色谱纯化的。

具体实施方式