[发明专利]一种蛋白质酪氨酸磷酸化分子识别材料与方法

说明书

本发明涉及材料分析化学领域。本发明提供一种磷酸化肽富集材料及其制备方法与应用。该磷酸化肽富集材料制备采用双模版印记策略，以十六烷基三甲基溴化铵和苯基膦酸为模板进行自组装，然后利用硅烷化试剂进行包硅，随后利用索氏提取法去除模板，制备得到了具有特定空腔的分子印迹材料。本发明对酪氨酸磷酸化具有良好的选择性识别能力，为蛋白质酪氨酸磷酸化的分析提供了新的选择。

技术领域

本发明属于分子印迹材料领域，具体涉及磷酸化酪氨酸、分子印迹技术，介孔材料等技术。

背景技术

蛋白质磷酸化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰，参与许多重要的细胞活动，包括细胞分化、细胞增殖、信号转导、分子识别和代谢过程等其中酪氨酸磷酸化虽然占比最低，但由于其在整个磷酸化过程的上游，对细胞信号的转导起着重要的作用，对癌症的发生发展也有着重要的调节功能。目前常用的磷酸化多肽富集方法无法区分不同的磷酸化形态，对酪氨酸磷酸化的富集主要还是依靠抗体的策略。

分子印迹技术是作为用于对相应模板分子大小、形状和功能基团“量身定制”空腔并在空腔内修饰上功能单体以提供相应位点的技术。基本原理是当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。70年代 , Wulff等人利用新的方法合成出了几种高分子 ,对糖类和氨基酸衍生物具有较高的选择性 ,被用作高效液相色谱(HPLC)的固相填充物[卢彦兵, 翁健. 分子印迹技术[J]. 高分子通报, 1999(2):61-65]。这种新的方法 ,被称为分子印迹。目前，分子印迹材料在色谱分离、天然抗体模拟、化学传感、药物运输及仿生催化等领域已经得到了广泛的应用。

介孔二氧化硅材料是一类物理化学性质稳定、无毒且生物兼容性强, 孔径介于2～50 nm。按照介孔是否有序, 可将介孔二氧化硅材料分为2类:无序介孔材料和有序介孔材料。无序介孔材料孔径范围较大, 孔道形状不规则, 如普通的SiO2气凝胶、微晶玻璃等。有序介孔材料孔径范围分布窄, 在2～50 nm间可调节, 且有规则的孔道结构, 如有序介孔氧化硅、MCM-41等[蔡幸美, 商雨婷, 王澈. 介孔纳米二氧化硅作为药物载体在癌症治疗中的应用[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2019, 35(3)]。介孔材料具有极高的比表面积、规则有序的孔道结构、狭窄的孔径分布、孔径大小连续可调等特点，使得它在很多微孔沸石分子筛难以完成的大分子的吸附、分离，尤其是催化反应中发挥作用。目前，介孔材料已经应用到化学化工、生物医药、环境和能源等领域。

发明内容

目前常用的磷酸化多肽富集方法无法区分不同的磷酸化形态，对酪氨酸磷酸化的富集主要依赖抗体策略，开发对酪氨酸磷酸化多肽的选择性富集有着重要的应用价值。本发明提供一种简便、选择性的蛋白质酪氨酸磷酸化分子识别材料与方法。

本发明的具体技术方案如下。

（1）介孔模板十六烷基三甲基溴化铵和0.6 g氢氧化钠加入到500 mL圆底烧瓶中；

（2）加入288mL去离子水加热到80℃，以800 rpm/min 持续15 min；

（3）加入63.3 mg 苯基膦酸500 rpm/min 持续 30 min；

（4）加入9.6 mmol TEOS , 0.4 mmol UPTES , and 200 μL methanol 的混合物，在剧烈搅拌的状态下逐滴加入，反应两小时产生白色沉淀；

（5）将得到的白色沉淀用乙醇洗几次，然后在40℃下真空干燥；

（6）利用索氏提取法去除模板，将干燥的材料加入到500 mL圆底烧瓶中，然后加入300mL甲醇和3mL 浓盐酸，然后进行索氏提取；