[发明专利]一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用，包含III型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3C；所述结构蛋白前体基因P1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白水解酶基因3C的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。经过密码子优化的基因在昆虫细胞中表达水平明显提高，可获得具有较好空间构型的蛋白，在胞内自发组装成病毒样颗粒(VLPs)，够获得高纯度、形态均一、性状稳定的病毒颗粒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种密码子优化鸭肝炎病毒样颗粒及其制备方法和应用，尤其涉及一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用。

背景技术

鸭甲型病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)引起的一种以肝脏肿胀、出血为主的急性、烈性传染病，主要侵害3周龄内雏鸭，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭肝炎病毒有3个血清型(I型，II型，和III型)，II型和其他两种血清型间无交叉反应性。以前我国主要流行的是I型鸭甲型肝炎病毒，临床上主要是弱毒疫苗和高免卵黄抗体进行预防和治疗，但目前临床上不断有弱毒疫苗免疫或高免卵黄抗体治疗无效的报道，研究结果已显示我国目前同时流行DHAV-1和DHAV-3，但使用I型鸭肝炎弱毒疫苗免疫，虽然可以很好的保护1型鸭肝炎强毒的攻击，但对III型鸭肝炎强毒没有抵抗力。

鸭甲型肝炎病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属。DHAV病毒核衣壳为对称的二十面体，无囊膜，核心为单股RNA，直径大小为20-40nm，对氯仿有耐受性。完整的基因组包含5’非编码区(5’UTR)，一个大的开放阅读框(ORF)，表达一个多聚蛋白，3’非编码区(3’UTR)和Poly(A)尾。此ORF可分为三区域：P1，P2，及P3。P1带有病毒壳蛋白：VP0，VP1，VP3。P2和P3则带有非结构蛋白如蛋白酶2A，3C，3C，及病毒聚合酶3D^pol。

DHAV VP1蛋白通常大部分暴露在病毒的表面，可以诱导机体产生中和抗体，是病毒吸附至细胞特异性受体的结合蛋白，也是决定病毒抗原性的主要成分，为病毒抗原性的高变区。DHAV-3VP1与DHAV-1之间存在较大差异，不仅出现点突变或连续变异，而且存在明显的插入或缺失现象，DHAV-3的抗原性发生变化有可能是VP1中氨基酸位点的变异导致的，因此DHAV-3便显出与DHAV-1的交叉反应性很低或无交叉中和反应。

CN106047824A公开了一种Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法。该发明将Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒结构蛋白前体基因P1和蛋白水解酶基因3CD在杆状病毒表达系统中共表达，制备并鉴定了鸭肝炎病毒样颗粒，为鸭肝炎病毒新型疫苗的研制奠定了基础。IFA结果显示重组蛋白在昆虫细胞中成功表达；以P3代病毒(MOI＝5)感染悬浮生长的昆虫细胞，收集细胞裂解液上清，可见直径约20～25nm的球形病毒样颗粒，与DHV天然病毒高度相似；但该方法生产III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒时蛋白表达效率低，收率不高，且活性差。

因此，提供一种血清III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒的制备方法，探究病毒样颗粒对疫苗的影响，为进一步研制诊断抗原及鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种重组表达载体、制备得到的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒、制备方法及应用，以血清III型鸭肝炎病毒HBGT株(GenBank：KX290465.1)为模板，将血清III型鸭肝炎病毒前体蛋白P1和3C蛋白酶基因按杆状病毒喜用密码子进行优化设计和人工合成，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得表达P1和3C基因的重组杆状病毒，经过密码子优化的基因在昆虫细胞中表达水平明显提高，可获得具有较好空间构型的蛋白，在胞内自发组装成病毒样颗粒(VLPs)，够获得高纯度、形态均一、性状稳定的病毒颗粒，为进一步研制诊断抗原及血清3型鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：