[发明专利]一种米曲霉脂肪酶及在制备布瓦西坦手性中间体中的应用

权利要求书

1.一种米曲霉脂肪酶在拆分外消旋2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)戊酸甲酯制备布瓦西坦手性中间体中的应用，其特征在于所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含米曲霉脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体冻干后的脂肪酶粗酶粉为生物催化剂，以外消旋2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)戊酸甲酯为底物，以pH7.0缓冲液为反应介质，在20-60℃、1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得布瓦西坦中间体R-2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)戊酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为20g/L-100g/L，所述底物体积终浓度为1％-3％。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于反应时间为5min-180min。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含米曲霉脂肪酶编码基因的工程菌接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至为0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干得到脂肪酶粗酶粉。

8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化制备产物的方法为：反应结束后，反应液先用的2M NaOH水溶液调pH至9.0，加入等体积的环己烷萃取分离未反应的S-2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)戊酸甲酯；然后用4M HCl水溶液酸化至pH 2.0，加入等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相，再经纯水洗涤两次，饱和NaCl洗涤两次，干燥，得到R-2-(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)戊酸。