[发明专利]一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法

权利要求书

1.一种磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，包括微生物保存缓冲液、溶菌液Ⅰ、蛋白酶K、硅胶磁珠、异丙醇、乙醇水溶液，其特征在于：还包括溶菌剂Ⅱ、裂解吸附液和加强洗涤液，所述溶菌剂Ⅱ包括MES、EDTA、Triton X-100、溶壁酶以及溶壁酶增强剂，所述裂解吸附液包括Tris-HCl、氯化钠、EDTA、TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂；所述加强洗涤液包括Tris-HCl、氯化锂和乙醇。

2.如权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述溶菌剂Ⅱ为10-100mM的MES，1-100mM的溶壁酶增强剂，5-150mM的EDTA，0.01％-5％的Triton X-100和0.1-10％的溶壁酶，所述溶菌剂Ⅱ的pH5.5-8.0。

3.如权利要求2所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述溶壁酶增强剂为三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。

4.如权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述裂解吸附液包括：10-100mM Tris-HCl，0.5-1.5M氯化钠，1-20mM EDTA，0.1％-5％TrionX-100以及核酸分离吸收促进剂，所述裂解吸附液的pH为6.0-9.0。

5.如权利要求4所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒，其特征在于：所述核酸分离吸附促进剂包括异硫氰酸胍、十二烷基硫酸三乙醇胺和硫脲。

6.如权利要求1所述的用于不同微生物基因组DNA的磁珠法提取试剂盒，其特征在于：所述加强洗涤液中包括10-100mM Tris-HCl、0.5-2M氯化锂和50-70％乙醇，所述加强洗涤剂的pH6.5-7.5。

7.采用权利要求1所述的磁珠法微生物基因组DNA的提取试剂盒的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将各种样本如革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和各种真菌放入微生物保存缓冲液中，充分混匀后离心，保留沉淀；

(2)向沉淀中加入50-200μL的溶菌液Ⅰ，进行混匀和孵育处理，混匀时间为10-60s，孵育处理时间为10-60min，使革兰氏阳性细菌的细胞壁水解，得到混合物Ⅰ；

(3)向混合物Ⅰ中加入50-200μL的溶菌液Ⅱ，进行混匀和孵育处理，混匀的时长为10-60s，孵育处理时长为10-60min，使真菌细胞壁水解，得到混合物Ⅱ；

(4)向混合物Ⅱ中加入的裂解吸附液和蛋白酶K进行混匀及孵育处理，混合物Ⅱ与裂解吸附液及蛋白酶K的使用量比例按体积份数比为：100-300：200-600：5-20，使原生质体或细胞的DNA与结合蛋白分离，得到混合物Ⅲ，所述振荡速度为500-1500rpm，所述孵育处理温度为55-70℃，孵育处理时间为5-30min；

(5)向混合物Ⅲ中加入异丙醇和硅胶磁珠进行振荡混匀，异丙醇的加入量与裂解吸附液的比例按照体积份数比为0.4-1.5:1，加入硅胶磁珠的量为5-20μL，使混合物Ⅲ中释放的DNA高效地吸附在硅胶磁珠上，所述振荡速度1500-3000rpm，所述孵育处理温度为15-30℃，所述孵育处理时长为1-10min；

(6)吸附完成后，使用磁力架分离磁珠，磁力架吸附硅胶磁珠的时长为3-10min或至液体清澈，再依次使用洗涤液I和80％乙醇水溶液对硅胶磁珠分别进行洗涤后分离，洗涤液I使用量为0.5-1mL，对洗涤分离后的硅胶磁珠进行烘干，烘干温度为37-60℃，烘干时长为1-5min，得到去除杂质的含有原生质体(细胞)基因组DNA的硅胶磁珠；

(7)利用洗脱液对硅胶磁珠进行振荡孵育洗脱，洗脱液的使用量为50-200μL，洗脱温度为37-60℃，振荡速度为500rpm-1500rpm，弃去磁力架分离的硅胶磁珠，收集洗脱液，得到基因组DNA。