[发明专利]生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法

权利要求书

1. 生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（一） DNA合成及重组菌构建

从NCBI数据库中获得编号为NP_031851.3的来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1-F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；

利用PTEF1-F/R和TCYC1-F/R引物扩增Saccharomyces cerevisiae By4742染色体基因组上的启动子PTEF1和终止子TCYC1，并通过基因拼接获的目的片段P-cyp7b1-T，并由通过限制性酶切位点Hind III/BamH I连接到表达载体pRS426上，获的目的重组质粒pRS426-cyp7b1；

敲除酵母染色体基因atf2和ayr1，具体步骤为：首先以S. cerevisiae By4742的染色体基因为模板，用atf2-Up-F/R及atf2-Down-F/R分别扩增得到atf2-UP和atf2-Down；然后以pRS415质粒为模板扩增获得LEU标签，利用Overlap PCR技术将三段基因拼接成atf2-UP+LEU+Down片段，并将此片段进行酵母转化实验，并于SC-L（亮氨酸营养缺陷型培养基）筛选培养基上获得基因敲除菌株S. cerevisiae Δatf2，利用同样的方法进行基因ayr1敲除实验，使用组氨酸HIS筛选标签获得双基因敲除型菌株S. cerevisiae Δatf2Δayr1，最后进行重组质粒pRS426-cyp7b1的转化实验并于SC-U（尿嘧啶营养缺陷型培养基）上选出目标重组菌株S. cerevisiae Δatf2Δayr1/cyp7b1实现组成型强启动子PTEF1调控的cyp7b1基因的过表达；

用于PCR的引物如下，引物序列为5’→3’：

cyp7b1-F：AATTACAAAATGAACGCCACAGAAACTG；

cyp7b1-R：GATGCGGCCCTTACAATTTTCTTCTTC；

PTEF1-F：CCCAAGCTTGCCGTACCACTTCAAAAC；

PTEF1-R：CGTTCATTTTGTAATTAAAACTTAG；

TCYC1-F：GAAAATTGTAAGGGCCGCATCATGTAATTAG；

TCYC1-R：CGCGGATCCGCAAATTAAAGCCTTCGAG；

atf2-Up-F：CTGAAGAATTTCAATGAACTGGAAGGCTCATCC；

atf2-Up-R：CTCTTGAGTGATATGTGGTTCGTATCCTTC；

atf2-Down-F：GAGCGTGGTTCAGGGCACTCTAC；

atf2-Down-R：CGTTAACAGCAGACATGACCCTTTTCTC；

（二） 生物电催化系统电池装置的预处理

①碳布阴极的预处理：首先将碳布裁剪为所需的尺寸大小，为2.5 cm × 3 cm，然后在1 M HCl溶液中浸泡过夜，用双蒸水反复冲洗干净，最后在纯丙酮中浸泡过夜， 取出烘干后，用适当长度的导线与预处理后的碳布连接并用胶水粘连固定住，晾干备用；

② 质子交换膜（PEM）的预处理：首先将质子交换膜裁剪为生物电催化电池所需的尺寸大小，然后在1 M HCl 溶液中浸泡过夜，用灭菌后的双蒸水反复冲洗干净，最后在无菌水中浸泡备用；

③ 生物电催化电池的组装：先将橡胶圈放在电池的阳极室和阴极室之间，然后用相配套的铁夹旋紧；阴极室内放入磁力搅拌子，碳布电极的导线穿透阴极室盖子上的导线孔伸到瓶盖外面，瓶盖上的通气孔与无菌滤器相连，把组装好的生物电催化电池装置放入高压蒸汽灭菌锅内121 ℃的条件下灭菌20 min；转移至烘箱中烘干，最后放入超净工作台内待用；

④阳极液的配制： 称取17.116 g K2HPO4•3H2O 和10.206 g KH2PO4于适量蒸馏水中彻底溶解，继续加蒸馏水定容至1.5 L，121℃的条件下灭菌20 min后备用；

⑤在超净工作台内，将灭菌并烘干后生物电催化电池阴阳极室之间的铁夹打开，用镊子夹取一张处理好的浸泡在无菌水内的质子交换膜放在阴极室和阳极室中间， 用夹子将阴极室和阳极室夹紧固定好，用量筒准确量取135 mL阳极液倒入阳极室中备用；

（三） P450酶生物电催化系统的组装

①细胞的培养及收集：从SC-U平板上挑取新活化的单菌落接入装有30 mL SC-U液体培养基的250 mL锥形瓶中，200 r/min、30℃振荡培养24 h；取1 mL转接到装有200 mL SC-U体液培养基的2 L锥形瓶中，继续振荡培养至OD =6；取35mL的培养液，5000 r/min离心2分钟，用50 mM磷酸缓冲液冲洗细胞3遍去除残留培养基培养基，重悬于135 mL阴极液中至OD600= 1.5，倒入阴极室中备用；

②提前30 min ~ 1 h将铂电极和Ag/AgCl参比电极电极放在超净工作台内用75%酒精擦拭，并在紫外灯照射下灭菌30 min左右；然后将阳极铂电极的穿透阳极室盖子上的直径6mm的孔伸到瓶盖外面，Ag/AgCl参比电极穿过阴极室盖子上的直径6 mm的孔伸到阴极室内，拧好阴极室的瓶盖；

③将各个装好的生物电催化电池从超净工作台拿出，放在磁力搅拌器上，设置温度为30 ℃，转速为150 r/min左右；将阴极瓶盖上的通气孔加上气体过滤装置并与装有空气的钢气瓶的管子相连接；

④打开电化学工作站和电脑，将生物电催化电池与电化学工作站相连，绿色线接阴极室碳布电极的导线，红色线接阳极室铂电极的导线，白线接阴极室 Ag/AgCl 电极的导线；设置电化学工作站恒电位电压 -0.6 V vs. Ag/AgCl、运行时间；

（四）样品的提取、处理及检测方法

每隔6 h或12 h取一次阴极发酵液500 μL，加入1 mL乙酸乙酯漩涡震荡2min、12000r/min取上清液于新的EP管中，重复7次，将所有上清液真空离心浓缩，最后加入适量乙腈溶解，经0.22 μm滤膜过滤后，取滤液进行HPLC检测；

色谱条件：C18色谱柱，Waters 4.6 × 250 mm；检测器，Waters 2998 PDA；流动相，水和乙腈；洗脱条件，线性梯度洗脱，乙腈：水 = 30 ~ 80%, 32min，45℃，1 mL/min，检测波长205 nm；

定量方法：使用相同的色谱条件测定DHEA与7α-OH-DHEA标准品的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对萃取液中的产物进行定量；

（五）生物量的测定

生物量：每隔6 h或12 h取适量发酵液，13000 r/min离心1 min沉淀细胞，洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的OD600值；

（六）胞内NAD(H/+)、NADP(H/+)比值测定

使用Bioquest AmpliteTM NAD/NADH比色分析试剂盒，AmpliteTM NADP/NADPH比色分析试剂盒测定；

具体步骤：取适量200uL发酵液，放入0℃离心机，10000xg，15min 尽除上清，加入50uL细胞裂解液，室温下培养15min，再次离心2500rpm , 5min，取上清液于新EP管中，并用pH=7的PBS缓冲液将其稀释3倍，取25 μL用于NAD/NADH或NADP/NADPH比色分析试剂盒测定；

电催化条件为：在恒电位-0.6 V vs. Ag/AgCl；

将不同量的底物DHEA加入阴极室中配置其终浓度从100 mg/L到500 mg/L的阴极发酵液，保持促溶剂M-β-CDs的摩尔量为底物DHEA的2倍，生物电催化系统维持在恒电位-0.6 Vvs. Ag/AgCl，NR最终浓度为0.1 mM。