[发明专利]一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法在审
申请号: | 201910612981.8 | 申请日: | 2019-07-09 |
公开(公告)号: | CN110283783A | 公开(公告)日: | 2019-09-27 |
发明(设计)人: | 李哲浩 | 申请(专利权)人: | 赛瑞诺(北京)生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0775 | 分类号: | C12N5/0775;A01N1/02 |
代理公司: | 北京细软智谷知识产权代理有限责任公司 11471 | 代理人: | 张肖 |
地址: | 101149 北京市通州区中关村科技园区通州园*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 种子细胞 冻存 脐带间充质干细胞 人源 分离培养 种子细胞培养 细胞 扩大培养 临床研究 脐带组织 贴壁培养 细胞活性 应用提供 动物源 冻存液 无血清 软骨 成骨 制备 标准化 分化 复苏 受损 保证 | ||
本发明涉及一种人源脐带间充质干细胞的培养和冻存方法,所述培养方法包括先从脐带组织中分离培养原代种子细胞,然后将原代种子细胞进行扩大培养的步骤,本发明通过在原代种子细胞培养阶段,创造性的采用第二次原代贴壁培养的方法,大幅缩短了原代种子细胞分离培养时间,提高了原代种子细胞数量,提高了原代种子细胞纯度,为临床研究和应用提供了充足的标准化种子细胞和培养方法。本发明制备得到的人源脐带间充质干细胞,在体、内外均可以向成骨、成软骨、成脂分化。本发明所述冻存方法通过采用无血清冻存液冻存体系,保证了所冻存细胞无动物源成分,且不使细胞受损,复苏后细胞活性好。
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell.UC.MSC)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,体外可诱导分化为骨、软骨、成脂分化、心肌、肝细胞样细胞,可广泛用于各种损伤和退变性疾病治疗,因其具有材料来源丰富、适于标准化制备、临床应用免疫原性低等特点,将成为未来干细胞临床应用的理想选择。Mitchell等首次从脐带华通胶中分离出成纤维样细胞,并且证实具有多向分化潜能后,通常对于脐带原代组织的培养方法主要有酶消化法、组织贴壁法以及两者结合的酶组织法,均分离得到脐带间充质干细胞。酶消化法成本高,消化时间难于控制,消化液黏稠而不易分离,而且胶原酶对细胞有直接损伤作用。传统的组织贴壁法较为简单,成本低,但是细胞爬出时间过长,通常需要10d左右,两者结合的酶组织法为贴壁培养酶消化后的组织块,方法虽也简易,细胞易于爬出。但是操作步骤比较繁琐。细胞接触东西比较多,容易污染,3种方法各有利弊,且现大部分脐带间充质干细胞制备体系采用胎牛血清,存在引进外源病毒等风险。脐带间充质干细胞的临床应用,必须建立简单、高效、稳定、规范的原代脐带间充质干细胞制备与鉴定技术,获得足够数量并符合临床要求的标准化的间充质干细胞,才能保证临床应用的安全性和有效性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题,本发明提供一种人源脐带间充质干细胞的培养方法,所述方法通过采用两次原代贴壁培养,大幅提高了原代种子细胞的数量,缩短了原代种子细胞分离培养时间,提高了原代种子细胞纯度。
本发明的技术方案为:
一种人源脐带间充质干细胞的培养方法,包括如下步骤:
(1)从脐带组织中取华通氏胶部分组织,剪切得到组织块;将所述组织块置于培养皿中,于37℃,5%CO2的培养箱中倒置培养2~4h,完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液,然后置于37℃,5%CO2的培养箱中,进行第一次原代贴壁培养,培养至第10~12天,先加入TrypLETM Express进行消化,再加入细胞培养液终止消化,收集得到第一次原代种子细胞;
(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中,然后置于37℃,5%CO2的培养箱中进行第二次原代贴壁培养,培养至第6~8天,先加入TrypLETM Express进行消化,再加入细胞培养液终止消化,收集得到第二次原代种子细胞;
(3)将第一次原代种子细胞与第二次原代种子细胞合并,得到总的原代种子细胞;将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中,然后置于37℃,5%CO2的培养箱中进行培养,培养至细胞生长至80~90%融合时,先加入TrypLETM Express进行消化,再加入细胞培养液终止消化,然后分种至新的培养瓶中进行传代培养,经数次所述传代培养,得到纯化的人源脐带间充质干细胞;
所述细胞培养液的原料组分为:DMEM+2%血清替代物+2~10ng/mlVEGF+2~10ng/ml BFGF+2mmol/L L-Gln。
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