[发明专利]一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒

权利要求书

1.一种时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其中检测卡包括吸水纸、NC膜、滤血膜、样品垫依次搭接的粘贴于PVC胶板的检测条和带有读数视窗的卡壳组成，其特征在于：反应部件包括荧光探针和包被在NC膜上的检测区和质控区；其中荧光探针为时间分辨荧光微球偶联HA抗体。

2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：所述荧光探针的制备包括如下步骤，

1)取0.01～0.05M pH为5.0-7.0的MES缓冲液置于离心管中；

2)向上述离心管中加入羧基修饰的时间分辨荧光微球，加入的荧光微球与缓冲液的体积比为1：5-1：20；

3)超声30s-1min进行重悬；

4)将上述分散均一的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物；

5)吸取0.01～0.05M pH为5.0-7.0的MES缓冲液加入到上述沉淀中，超声30s-1min进行重悬；

6)向分散均一的体系中加入10-20mg/mL的EDC和10-20mg/mL的NHS，室温混匀15-20min后，8000-12000g离心10-15min，弃上清，沉淀物用上述MES缓冲液复溶，置于2-8℃储存备用；

7)将一定量的HA抗体加入到步骤6)中所述的体系中进行偶联，使其终浓度为60-500μg/mL，室温旋转混匀2-4h；

8)向步骤7)中所述的偶联体系中加入质量体积比为8-10％的BSA，使其BSA的终浓度为1-2％，终止偶联，此过程需室温旋转混匀0.5-2h；

9)将步骤8)中所述的已终止偶联的体系置于高速冷冻离心机中，2-8℃条件下，8000-12000g离心10-15min，取出后弃上清，保留沉淀物；

10)用含蔗糖质量浓度为5-8％，海藻糖质量浓度为3-5％以及体积浓度为0.03-0.3％的Procline300的pH为5.0-7.0的0.01M MES缓冲液，将沉淀物重悬，得到用于检测HA的荧光探针浓储液；

检测HA的荧光探针浓储液中HA的抗体浓度为60-500μg/mL。

3.根据权利要求1所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：检测区包被有HA-BSA偶联物；质控区包被有亲和素或链霉亲和素(SA)；包被有SA和HA-BSA的NC膜，通过将包被液喷涂在NC膜的质控区和检测区获得；

所述的包被液是将SA和HA-BSA分别用含有质量浓度为0.5％-2％蔗糖、质量浓度0.1％-1％海藻糖、体积浓度0.03％-0.3％procline 300 0.01M的PBS(pH7.0-8.0)的缓冲液配制成终浓度0.5-2.5mg/mL的溶液，优选的配制成终浓度0.6-1mg/mL的溶液；含SA的包被液喷涂在质控区、含HA-BSA的包被液喷涂在检测区，喷涂量控制在0.5-1.5μL/cm，优选的0.75-1μL/cm。

4.根据权利要求1或2所述的时间分辨荧光免疫层析透明质酸测定试剂盒，其特征在于：时间分辨荧光微球内部包裹有镧系稀土元素；优选的，Eu(铕)和Tb(铽)；且时间分辨荧光微球的粒径为100-300nm，优选的，200nm。