[发明专利]一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用

说明书

本发明提供了一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用，所述保护剂包括鲑鱼精DNA。本发明选取TP53基因的一段长度为300bp的序列作为目标片段，研制低浓度水平的DNA标准物质，采用浓度为20μg/mL～100μg/mL的鲑鱼精DNA作为保护剂进行保护，贮藏在低吸附离心管中放置在‑15℃～‑20℃的冷冻条件下，维持了DNA标准物质在6个月内的浓度稳定性；所述标准物质均匀性、稳定性良好，保证了生物前沿检测技术的准确可靠性，提升了临床检测和癌症早期诊断的检测能力，为精准医疗计划提供可靠的计量支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用。

背景技术

基因的异常表达是引起疾病的重要因素，在疾病的诊断和治疗过程中只有准确靶向异常基因并进行精准定量，才能进行疾病的精准治疗。由于人体内环境的复杂性以及异常基因表达量通常较低，准确可靠地检测低浓度的目标基因，是精准医疗成果临床应用的一个重要挑战。循环肿瘤DNA(ctDNA)是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可以无创的用于肿瘤早期诊断、发展过程检测、预后判断、以及个性化用药指导，然而ctDNA的含量非常低，约占整个循环DNA的1％，甚至0.1％，准确进行ctDNA的精准定量，对基因检测方法提出了巨大挑战。目前，基因检测方法的检出限越来越低，但是准确性和可靠性并未得到显著提高，低浓度核酸样品在稀释、扩增定量或传感的过程中，可能产生的偏差为最终结果的准确性带来了很大的不确定度。研究发现，对于浓度为10¹⁰copies/μL的质粒DNA样品，采用紫外(UV)进行定量，不确定度低于1％，将样品进行2000倍稀释后采用高分辨电感耦合等离子体质谱法(HR-ICP-MS)进行定量，不确定度上升近3倍，而将样品进行10⁹倍稀释并采用PCR检测时，不确定度上升至约20％。

为了促进基因检测方法的进一步发展，需要开展方法标准化研究，通过研制低浓度水平的核酸标准物质，为检测方法提供可靠的计量依据。目前，具有可靠准确度和清晰溯源链的检测方法较少。UV是基于核酸在260nm处的紫外吸收值进行绝对定量的方法，但该方法对纯度要求高且灵敏度低。HR-ICP-MS通过检测DNA分子中的P元素含量可以直接溯源至国际单位制，该方法稳定性好，检测灵敏度达10⁶copies/μL，但需要复杂的样品处理步骤。

数字PCR(dPCR)是一种新兴的核酸定量检测方法，该方法不依赖标准曲线和标准样品，不受稀释过程的影响，利用高通量芯片和单分子水平扩增，实现了基因样品的绝对定量，检测灵敏度高，理论上是低浓度水平基因标准物质研制的最佳方案。国际物质的量委员会下设的生物分析工作小组对dPCR高度重视，提出将dPCR作为DNA检测的量值溯源的主要方法。国际上其他计量组织，已经利用dPCR作为定值方法开展了DNA标准物质的研制，该项工作为DNA相关标准物质的研究起到重要的指导作用。

CN106011133A公开了一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，利用重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切和DNA连接等方法将100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp等长度的小的DNA序列构建到一个质粒上，这种质粒经单一的限制性酶完全酶切后，可以酶切出七条亮度均一的条带，本发明用于制备DNA标准参照物，用于在琼脂糖电泳中指示DNA分子量的相对大小，但是上述DNA标准参照物不存在浓度低的特性，不能作为目标序列用于研究ctDNA。

因此，构建一种低浓度水平短链DNA标准物质，模拟ctDNA，研究其保存条件、均匀性和稳定性，在精准医疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种低浓度DNA标准物质的保护剂、保存方法及应用，所述保护剂包括鲑鱼精DNA，有利于保持DNA标准物质的稳定性、均匀性和浓度一致性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：