[发明专利]一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用

说明书

本发明提供一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述褐藻胶裂解酶基因核苷酸序列的如SEQ ID NO.1所示；褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；含所述基因的重组载体是褐藻胶裂解酶基因连接至大肠杆菌质粒或酵母质粒；含所述基因的细胞由所述重组载体转化而得；所述褐藻胶裂解酶基因的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述重组载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述重组载体转化的毕氏酵母。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用。

技术背景

褐藻胶裂解酶以来源于海洋生物为主，包括海洋微生物，无脊椎动物，藻类等。研究发现最多的褐藻胶裂解酶是多糖裂解酶第7家族(PL7），褐藻胶裂解酶可以将褐藻胶降解成具有多种活性的低聚糖或者寡糖，已经在细菌中已经得到了很好地研究。2018年，Jingjing Zhuang等人报道了一株来源于弧菌，属于多糖裂解酶第7家族的新褐藻胶裂解酶，它包含了两个连续的PL7结构域，可以降解褐藻胶生成二-、三-、四-褐藻胶低聚糖。2018年，ChunePeng等人发现一株属于多糖裂解酶第7家族的内 型褐藻胶裂解酶，对重组酶使用不同的糖链作为测试底物发现其具有双功能，重组酶催化模块的改变可以产生不同水平的低聚糖。2018年，Peng Chen等人从海洋芽孢杆菌中纯化出一株高比活的褐藻胶裂解酶，主要降解褐藻胶产生二糖，三糖和四糖。

褐藻胶裂解酶的作用机制是在1- 4糖苷键位置通过β消去机制作用于古洛糖醛酸和甘露糖醛酸，同时在糖苷键断裂的非还原端碳骨架C4和C5间产生一个双键，形成一个特殊的结构，这个特殊结构的产物是裂解酶的特有产物，会在230-240 nm有特殊吸收峰。

褐藻胶裂解酶有多种分类的方式，可根据作用方式、底物专一性、分子量大小和初级结构等方面来分析褐藻胶裂解酶，了解它的结构和性质。褐藻胶裂解酶的分子大小是25kDa到110kDa不等，最适温度范围在25℃到50℃，最适PH在5-10之间。多数的褐藻胶裂解酶是诱导型表达，内切型降解酶；少数或者极少数是组成型，外切型降解酶。

大肠杆菌表达系统研究的比较清楚，而且易操作，生长周期短，然而，在大肠杆菌中异源表达的蛋白质易于形成包涵体。胞内酶的表达需要机械破坏以从细胞中释放，这可能导致酶失活或酶活性降低，限制了褐藻胶裂解酶的大规模生产和应用。而毕赤酵母操作复杂，其生长周期较长。但是具有高拷贝，高密度发酵，表达基因稳定在宿主基因组中等优点，因此选择合适的宿主也至关重要。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种褐藻胶裂解酶及其基因和应用。以及将褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，提供具有潜在应用价值的新酶源。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

含有褐藻胶裂解酶基因的重组载体是褐藻胶裂解酶基因连接至大肠杆菌质粒或酵母质粒的重组载体；优选的所述的重组载体为pET28a(+)-Alginate lyase或 pPIC9k - Alginate lyase。

含有褐藻胶裂解酶的基因的细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞为受体细胞；所述细胞由所述重组载体转化而得；所述细胞是包含所述核苷酸分子或用所述重组载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述重组载体转化的毕氏酵母。

具体为：