[发明专利]一种利用酿酒酵母直接分泌表达成熟双链甘精胰岛素的方法

说明书

本发明公开了一种利用酿酒酵母直接分泌表达成熟双链甘精胰岛素的方法。该方法首先构建过表达Kex2的底盘细胞，然后将串联信号肽及密码子优化的甘精胰岛素DNA转入过表达Kex2的底盘细胞中，形成酿酒酵母共表达体系，进行蛋白表达纯化，即可得到甘精胰岛素。该方法极大降低了甘精胰岛素生产工艺难度，使传统工艺中下游多步繁琐复杂的加工流程得以简化，让酵母细胞在胞内直接完成修饰工作。同时，此法降低了纯化复杂性，可通过一步成本相对低的离子交换纯化直接从培养基中提取成熟的胰岛素蛋白。另外，由于避免使用胰蛋白酶等成分，避免了原有工艺中接近50％的副产物，提升了培养基中碳源等营养物质的发酵使用效率，具有很好的推广应用前景。

技术领域

本发明属于蛋白药物生产技术领域。更具体地，涉及一种利用酿酒酵母直接分泌表达成熟双链甘精胰岛素的方法。

背景技术

糖尿病是当今社会高发的慢性疾病。胰岛素类产品是糖尿病市场第一大用药品种，占据53％左右市场份额，其中又以三代重组胰岛素为主。甘精胰岛素属于第三代重组胰岛素，是一种长效胰岛素，没有明显峰值及其引发的低血糖、猝死等风险，由于其安全性、长效性的特点，甘精胰岛素Lantus持续数年成为胰岛素市场中市场份额最大的产品，占整体胰岛素市场的30％以上。

现有甘精胰岛素生产方式多为通过大肠杆菌生产甘精胰岛素单链前体，经过体外变复性后，通过胰蛋白酶、羧肽酶等蛋白酶在体外水解加工形成成熟双链结构，继而通过一系列纯化手段去除混杂的蛋白酶及其他衍生物杂质后，纯化得到甘精胰岛素。然而，该方法有一定缺陷，首先，大肠杆菌实现高产量的原因是通过内涵体大量聚集胰岛素蛋白，但这为下游分离纯化工作带来巨大挑战，相比较于分泌表达而言大幅提升了生产成本。破碎收集内涵体的过程会引入大量大肠杆菌宿主中内源蛋白及内毒素等物质，需要再纯化过程中将这类蛋白严格去除掉以避免人体严重的免疫反应(Nilsson et al.,1996)。并且，内涵体的变复性条件控制较为严苛，显著影响胰岛素得率。并且变复性涉及强酸强碱尿素等物质，对工业设备要求较高。其次，大肠杆菌缺乏翻译后修饰的能力，二硫键无法形成，且蛋白无法正确折叠。此过程需要让胰岛素以内涵体形式生产后，通过体外的变复性以及氧化的过程使得二硫键正常形成并正确折叠(Walsh et al.,2006)。另外，由于大肠杆菌胞内包含大量各类蛋白酶体，避免蛋白在胞内降解也是胰岛素菌株选择过程中一个重要问题。使用大肠杆菌作为宿主，现有技术首先发酵获得胰岛素原的包涵体，之后在体外经过繁琐复杂、成本高昂的变复性、酶切、纯化形成成熟胰岛素。由于B链中包含碱性氨基酸残基赖氨酸、精氨酸会被胰蛋白酶识别为切割位点，因此使用胰蛋白酶体外处理胰岛素原时，会产生接近50％的副产物，浪费了原材料的同时，增添了纯化成本(Zimmerman et al.,2012)。

另外，也有通过酵母发酵的方法，然而生产工艺仍然是先通过酵母发酵生产甘精胰岛素单链前体，经过体外变复性后，通过胰蛋白酶、羧肽酶等蛋白酶在体外水解加工形成成熟双链结构，继而通过一系列纯化手段去除混杂的蛋白酶及其他衍生物杂质后，纯化得到甘精胰岛素。一方面酿酒酵母作为胰岛素生产宿主，相比大肠杆菌显著简化了纯化步骤、降低了纯化成本。然而，使用酿酒酵母生产仍然未能避免在体外进行酶切以及形成大量副产物，浪费碳源原材料的同时，也浪费了生物酶制剂，并非精巧高效的生产方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有甘精胰岛素制备工艺的缺陷和不足，通过酿酒酵母作为表达体系，借助酿酒酵母的蛋白加工系统，过表达内源性Kex2蛋白酶，对甘精胰岛素前体的Arg-Arg识别位点进行切割，使胰岛素在酿酒酵母细胞内进行加工修饰，直接形成双链且带有二硫键的成熟胰岛素。之后借助酿酒酵母的蛋白分泌系统，通过信号肽将胰岛素分泌到细胞外，通过简单的离子交换纯化即可得到成熟的甘精胰岛素。

本发明的目的是提供一种利用酿酒酵母直接分泌表达成熟双链甘精胰岛素的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：