[发明专利]一种对虾细胞连续培养方法

权利要求书

1.一种对虾3D培养细胞的传代方法，其特征在于，所述的传代方法是将对虾外周血淋巴细胞的3D培养方法培养的生长于基质胶表面的对虾外周血淋巴细胞用0-4℃预冷的PBS溶液洗涤细胞后，加入与对虾细胞完全培养基的渗透压相同的细胞回收液，然后在0-4℃条件下将基质胶溶解；将溶解的基质胶细胞悬液在3000g，4℃离心5-10分钟，弃上清；将沉淀用对虾细胞完全培养基重悬，接种至新的培养板中的基质胶上进行传代培养；所述的细胞回收液的渗透压为560-620 mOsm/kg；

所述的PBS溶液的配方如下：12.0 g/L NaCl，0.3 g/L KCl，4.5 g/L Na₂HPO₄·12H₂O和0.3 g/L的KH₂PO₄，pH值7.2~7.4，高压灭菌，4℃保存；

所述的对虾外周血淋巴细胞的3D培养方法，是将对虾细胞悬液加入到已铺有基质胶的培养孔中，再补加对虾细胞完全培养基，再放置于CO₂培养箱中进行培养，培养期间更换对虾细胞完全培养基；

其中CO₂培养箱中进行培养，是在28℃、3%CO₂培养箱中培养；培养4 h后，更换对虾细胞完全培养基；

其中已铺有基质胶的培养孔，是将4℃预冷的基质胶以55-80 μL/cm² 的比例加入到培养孔中；基质胶自然摊平后凝固制成的；且基质胶自然摊平后，使其不充满整个培养孔的底部；

所述的对虾细胞完全培养基，是在对虾细胞基础培养基中，使用前加入了15%胎牛血清、20% 卵巢提取液、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子bFGF和 20 μg/L表皮生长因子EGF；

其中对虾细胞基础培养基的配方为：20.55 g/L Leibovitz's L-15 培养基粉末、5 g/L NaCl、2 g/L葡萄糖、1 g/L NaHCO₃、166.7 mg/L组氨酸，50 mg/L赖氨酸，50 mg/L甲硫氨酸，33.3 mg/L色氨酸，30 mg/L脯氨酸，30 mg/L牛磺酸、0.25 mg/L两性霉素B、100 IU/L 青霉素和100 mg/L链霉素，pH值7.2-7.4；

所述的卵巢提取液，是将对虾卵巢组织匀浆后，用上述的对虾细胞基础培养基在4 ℃提取，提取液在4 ℃，10000 rpm离心取上清；上清液依次用0.45和0.22µm滤膜抽滤除菌制成的。