[发明专利]一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法

权利要求书

1.一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.3D打印水溶性聚合物材料A制备血管支架收集棒：其结构为圆柱形空心结构，内径2.5～4mm，外径3～4.5mm，且圆柱外表面设计多条等宽度脊，所述收集棒采用水溶性聚合物材料A通过FDM打印成形；

b.采用静电纺丝工艺制备组织工程血管内层：聚L-乳酸与聚己内酯分别以19％和5％的浓度通过超声处理溶解在六氟异丙醇中直至完全溶解，然后以1:1比例均匀混合后添加到注射器中；使用注射泵以0.8～1.2ml/h的流速输送聚合物溶液，将a步骤中打印的收集棒安装在旋转轴上作为静电纺丝收集平台，其旋转轴转速设为：800～1000r/min；在注射器针头和收集棒两端施加电压，将电纺的纳米级纤维丝缠绕接收于收集棒上，作为血管支架的内层；

c.采用湿法纺丝工艺制备具有周向取向纤维的中间层：将配制好的聚L-乳酸与聚己内酯混合溶液装入注射器中，所述注射针浸入乙醇的凝固浴中，用注射器泵驱动溶液的滴流以1～2ml/h的流速挤出到凝固浴中；将纤维以800～1000r/min收集到旋转的不锈钢杆上6min；然后用乙醇洗涤纤维包裹的不锈钢杆3次，然后在真空干燥器中干燥两天以除去残留溶剂；再将湿法纺丝的纤维在步骤b制备完成的血管支架的内层外表面上缠绕呈周向排列结构，形成具有纤维周向排列结构的血管支架中间层；

d.电纺血管支架外层：将聚合物材料B以10～12％w/v完全溶解到溶剂A中，装入10ml注射器，再在步骤c制备完成的血管支架中间层外部电纺一层聚合物材料B，其电纺条件为：电压为10～12kv，注射速度为1～3mL/h，收集棒的转速控制在800-1000r/min，针头到收集棒之间的距离为10～15cm，电纺时间为3～5h，最终获得完全包覆内层与中间层的聚合物材料B层；

e.去除血管支架收集棒，对血管支架进行真空干燥：将上述制备完成的结构拆卸下来放入培养皿中，在培养皿中加入去离子水浸没血管支架，30min后内层的血管支架收集棒由于其材料的水溶特性逐渐变软易去除，收集棒的空心结构能够防止聚合物材料A在遇水膨胀后影响血管支架的尺寸，在对血管支架不产生损坏的情况下去除收集棒，将血管支架收集棒完全去除后，将支架放入真空干燥箱2天，去除残余水分和溶剂；最终得到内层具有轴向凹槽，中间层周向排列的组织工程血管支架；

f.血管支架肝素化：以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺氢氯化物和N-羟基磺基琥珀酰亚胺为交联剂，以二氨基聚乙二醇为间隔物，对血管支架进行肝素共价连接；通过在氢氧化钠中短暂水解10分钟，提高表面碳氧基的密度；在磷酸盐缓冲盐水中彻底冲洗支架，然后用去离子水冲洗；然后使支架在室温下含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml的di-NH₂-PEG的2-(N-吗啡酮)乙磺酸缓冲液，pH5.5，中反应3小时，在PBS中冲洗支架，然后在含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml的未分级肝素钠盐的MES缓冲液，pH5.5，中反应3小时；在肝素修饰之后，在PBS中使用10mg/ml甘氨酸彻底洗涤支架30分钟，淬灭剩余的反应位点；

g.血管内皮细胞生长因子的固定：将VEGF固定到血管支架上，在含1、2和4μg/ml的重组人VEGF-165的PBS溶液中在4℃条件下在振荡器上放置16小时培养支架；在VEGF固定后，在PBS中重复冲洗支架30分钟；最终获得接枝肝素与血管内皮细胞生长因子的原位组织工程血管支架。

2.根据权利要求1所述复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，所述步骤a中，制作血管支架收集棒的聚合物材料A为可溶于水的聚乙烯醇PVA。

3.根据权利要求1所述复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，所述步骤a中，血管支架收集棒的外部设计为多条等宽度脊，脊的数量为4～8条，每条脊的长度与收集棒等长，宽0.3～0.9mm，高0.2～0.5mm，通过FDM技术成形，收集棒外部形状导致静电纺丝的内层图案化，轴向凹槽结构引导内皮细胞黏附生长、减小血液流动阻力的作用。

4.根据权利要求1所述复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，所述步骤d中，聚合物材料B为聚(L-乳酸-ε-己内酯)PLCL、热塑性聚氨酯TPU、聚己内酯PCL高分子聚合物中的一种；溶剂A为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺DMF、四氢呋喃THF、六氟异丙醇HFIP中的一种或两种。