[发明专利]一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法

说明书

本发明提供了一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，包括以下步骤：(1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液；(2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记；(3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫检查点蛋白在不同亚群细胞中的表达水平。本发明在高度异质性的肿瘤相关免疫细胞中准确反映肿瘤免疫治疗临床响应程度的免疫细胞亚群；确定合适的肿瘤免疫检查点蛋白的表达水平阈值，使检测结果获得最佳的临床相关性。有较好的临床应用前景和较大的社会效益。

技术领域

本发明涉及医疗器械，具体涉及单细胞检测的方法，尤其涉及利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法。

背景技术

在肿瘤微环境中存在复杂的肿瘤免疫应答，机体的免疫系统可以识别并清除存在的肿瘤细胞，肿瘤免疫应答主要分为7个环节：1.释放肿瘤抗原；2.呈递肿瘤抗原；3.激活效应T细胞；4.T细胞向肿瘤组织转移；5.T细胞浸润肿瘤组织；6.T细胞识别肿瘤细胞；7.T细胞清除肿瘤细胞。但是不同的肿瘤细胞会通过不同的方法对人体的免疫应答存在抑制效应，从而逃避免疫细胞的杀伤，产生免疫抑制、免疫耐受，促进肿瘤的发生和进展，肿瘤细胞的这一特征被称作免疫逃避。

肿瘤免疫治疗就是基于肿瘤的免疫逃避的特征，通过对免疫检查点的抑制，重新启动并维持肿瘤免疫应答，恢复机体免疫系统对肿瘤的杀伤效果。这种疗法是一种基于人体自身免疫系统的新型肿瘤治疗手段，具有效果显著、疗效长期、副作用小等优点，是新一代的肿瘤治疗手段。近年来针对肿瘤免疫检查点的抗体类药物在临床中针对黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤中表现出强大的治疗潜力，有望实质性改善患者总生存期。

常见的免疫检查点包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、OX40、ICOS、4-1BB等。PD-1(程序性死亡蛋白-1)，主要表达于激活的T细胞/B细胞上，是肿瘤免疫治疗的热门靶点之一，目前已上市的单抗抑制剂有美国FDA批准上市的纳武单抗(Nivolumab)和帕姆单抗(Pembrolizumab)，用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌等适应症。PD-1的配体PD-L1(程序性死亡蛋白配体-1)在抗原呈递细胞等多种组织中表达，也可作为肿瘤免疫治疗的靶点，目前美国FDA批准上市的PD-L1抑制剂有阿特珠单抗(Atezolizumab)、度伐单抗(Durvalumab)和阿维单抗(Avelumab)。PD-1/PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，抑制T细胞对肿瘤的杀伤效果。

CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)是表达于活化T细胞表面的蛋白，作用于免疫应答启动阶段，它的激活抑制T细胞的活化并减少记忆T细胞的生成，实现免疫逃避。目前两种CTLA-4抑制剂(伊匹单抗Ipilimumab和西木单抗Tremelimumab)获美国FDA批准上市，用于黑色素瘤治疗，及其他癌种的临床研究。

LAG3(淋巴细胞活化基因3)分布于多种免疫细胞，LAG3信号的活化抑制T细胞的增殖与活化，并参与调节T细胞的免疫抑制功能。TIM-3(T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3)表达于活化的T细胞，树突状细胞表面，激活的TIM-3通过多种方式抑制T细胞的免疫应答，在肿瘤的免疫逃避中起到重要作用。目前已有多个针对LAG3，TIM-3的抑制剂药物进行临床或临床前研究，可能会对多种肿瘤患者的治疗具有积极的作用。