[发明专利]一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法

权利要求书

1.一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)收集患者的血液样本或者病灶组织活检样本；

(2)利用金属元素标记的抗体对样本中的细胞同时进行多靶点标记；

(3)将标记好的细胞样品通过质谱流式检测系统进行检测；

(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平；

(5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。

2.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)将血液样本离心、过滤后用1mL磷酸盐缓冲液重悬制成单细胞悬液，或者活检组织样本用解剖剪刀解离成细碎小块，加入0.025％胰蛋白酶细胞消化液，37℃消化10分钟，经70微米滤膜过滤，制备成单细胞悬液；单细胞细胞悬液中加入1/10体积的16％甲醛溶液，25℃固定10分钟；弃去上清，加入1mL染色缓冲液清洗细胞，离心弃去上清，重复2次，并用0.5mL染色缓冲液重悬细胞；所述染色缓冲液为含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)将单细胞悬液中加入所述染色缓冲液配制的金属标记的抗体混合物，室温25℃混合孵育30分钟。

4.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述抗体包括：a)免疫细胞基础分型组合、b)骨髓细胞分型组合、c)T淋巴细胞分型组合、d)B淋巴细胞分型组合，使用时选择其中任意1种或多种组合进行联合标记。

5.根据权利要求4所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(2)所述a)免疫细胞基础分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD45、CD11b、CD16、CD20、CD56、CD3、CD11c、CD19、CD27、CD8a、CD4、CD14；所述骨髓细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD11c、CD123、CD68、CD66、CD13、CD11a、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD33、HLA-DR、Siglec8；所述T淋巴细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：CD127、CD45RA、CD45RO、FOXP3、CD183/CXCR3、CD185/CXCR5、CD194/CCR4、CD196/CCR6、CD197/CCR7、TCRgd、CD25/IL-2RA、CD3、CD34或CD11b；所述B淋巴细胞分型组合抗体组合选自识别下列靶点的抗体：IgD、CD24、CD27、CD19、CD20、CD36或CD38。

6.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述所述步骤(2)用于作为抗体标签的金属元素及其不同原子质量的稳定同位素选自：钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铂Pt或铋Bi。

7.根据权利要求1所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，步骤(5)所述质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息；将多维的蛋白丰度信息进行降维算法数据处理，绘制一系列二维散点图；数据进一步进行SPADE分析。

8.根据权利要求1或4所述一种基于单细胞的免疫细胞分型定量分析方法，其特征在于，所述步骤(5)SPADE分析步骤为：

(1)密度相关的下采样，先求出每个细胞邻近范围内的细胞数，作为其密度。将密度小的细胞保留，密度大的细胞随机采样，保证细胞越稀疏则留下的概率越大，这样在保留了细胞绝大部分类型的同时，减少了细胞数，降低了后续计算量；

(2)凝聚层次聚类，将留下的细胞采用层次聚类的方式，聚成指定数量的类，该步骤将性质相近的细胞聚为一类，方便后续分析；

(3)建立最小生成树，计算出聚出的每个类的中心并计算出每个类中心的距离作为相邻类间边的权重，构造出一幅加权无向图。采用Prim算法建立该图的最小生成树；该步骤将细胞的类群构造成为一个树形结构，可以较好地揭示细胞类群之间的联系；

(4)上采样，计算每一个细胞分别与各个类群中心的距离，并将该细胞归入与其距离最近的那个类群，这样就将所有细胞都归入了相应的类群；

(5)可视化，采用Kamada-Kawai算法，根据得到的最小生成树计算出最小生成树中每个结点的二维坐标，根据每个结点上的细胞数量决定该结点的尺寸大小，对于某个特定的特征，计算出每个结点上该特征的中值，根据数值的高低决定该结点的颜色，这样，对不同的特征，就能生成结点坐标和尺寸一致的对应颜色的图像，建立生物信息学分析模型，通过机器学习算法对免疫细胞分型亚群组成进行分析，对各个免疫细胞亚群进行绝对定量以及跨类群之间进行相对定量分析；

根据每个细胞亚群中细胞表面抗原的表达水平，定义每个亚群的细胞类别，对每个细胞亚群的细胞数量进行绝对定量分析，以及不同亚群细胞之间进行相对定量分析。