[发明专利]一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，设计chIRF3的引物扩增其cDNA，双酶切处理扩增产物和PET‑32a质粒再连接构建重组载体，导入感受态DH5α细胞，筛选阳性克隆重组体并转入BL21细胞，涂布含Amp的LB固体培养基中37℃倒置过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB培养基中过夜培养，加入IPTG诱导表达，并优化诱导条件，纯化chIRF3蛋白后免疫大白兔，制备多克隆抗体，多克隆抗体经过Western‑Blot检测鉴定。结果扩增得到chIRF3片段长度为1488bp，重组质粒chIRF3‑PET长度为7388bp，重组质粒双酶切结果的两条带分别是5900bp和1488bp，由此可得chIRF3‑PET重组成功。重组质粒原核表达的蛋白分子量为83kDa，诱导表达最佳诱导时间为4h，IPTG诱导最佳浓度为0.08mmol/L，利用chIRF3蛋白制备的多克隆抗体对chIRF3蛋白具有明显特异性。

技术领域

本发明涉及一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，尤其涉及一种对chIRF3蛋白具有特异性多克隆抗体的制备方法。

背景技术

干扰素调节因子(IRF)是一种由生物体的淋巴细胞或单核细胞在机体受到病毒或其他诱生剂的作用下产生的分泌性可溶糖蛋白。IRF生物学活性为造血发育，细胞生长，细胞凋亡和肿瘤发生等方面。IRF家族中鸡源IRF3(chIRF3)表现出对病毒感染有着独特反应，研究表明鸡源IRF3(chIRF3)对于干扰素基因IFN的表达调控比IRF1的作用还重要。chIRF3基因定位19q，编码427个氨基酸，蛋白的分子量55kDa，结构为螺旋-转角-螺旋。chIRF3从N端到C端的结构域为DNA结合结构域DBD，转录活化结构域TAD，反应结构域RD，在细胞静息状态下，chIRF3处于细胞质中不参与他蛋白物质结合并且表现为单体失活状态，原因是TAD两侧有两个自身抑制结构域AID起到掩盖TAD作用,防止chIRF3移至细胞核与核内的DNA结合。一旦受到病毒干扰入侵或dsRNA刺激，chIRF3活化是受C端上的第385-386位丝氨酸和396-405位的丝氨酸的作用，在苏氨酸调控下IRF-3磷酸化分子内的自身抑制域被打开后，TAD与DBD暴露出来形成磷酸化的chIRF3且促进IRF-3的表达。当受到病毒感染时chIRF3磷酸化，诱导相关激酶、IFN的表达，干扰病毒基因转录翻译，从而达到阻止或限制病毒感染作用。chIRF3在病毒免疫防御，急性肝损伤，肿瘤方面都有重要的调节作用。chIRF3主要的研究领域是chIRF3的磷酸化,抗病毒通路等。本研究制备的chIRF3多克隆抗体能为鸡的chIRF3调节免疫的抗病毒通路研究尊定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，具有对chIRF3蛋白具有特异性的特点。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，其创新点在于，所述chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

步骤①：引物设计，引物序列如下：

chIRF3-F：5’-GGGGTACC(KpnⅠ酶切位点)ATGGCAGCACTGGACAGCGAG-3’；

chIRF3-R：5’-GGGAAGCTT(KindⅢ酶切位点)TCAGTCTGTCTGCATGTG-3’；

步骤②：cDNA的扩增，将新鲜的鸡肝脏组织研磨成细胞，提取总RNA后使用RNA纯化试剂盒纯化，利用HiFiScript cNDA第一链合成试剂盒逆转录成cDNA；

步骤③：以逆转录产物cDNA作为模板，配置25μl的PCR扩增体系扩增；