[发明专利]一种昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法

权利要求书

1.一种昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)活体昆虫触角进行氯化镍溶液或氯化钴溶液浸染；使用微量加样器的加样枪头，并切去枪头尾端，然后将昆虫冰冻麻醉后放入枪头尾端，并通过微力向枪头尖端处推挤，使得昆虫头部被枪头尖端处固定，露出触角，枪头被固定在载玻片上的橡皮泥或牙科蜡中；在解剖镜下用眼科剪在触角鞭节尖端处小心剪出一缺口；同时，在同一载玻片上的另一端位置，将含有氯化镍溶液或氯化钴水溶液的毛细玻璃管或玻璃电极固定在另一块橡皮泥或牙科蜡中，小心将含有氯化镍或氯化钴水溶液的毛细玻璃管套住触角切口处，使切口处浸没在溶液中，保持通畅；然后将载玻片移入放有湿润滤纸条的玻璃培养皿中，保持50％～70％湿度，室温下放置2-48小时；

(2)显微分离活体昆虫完整的触角和脑；将50mL的Ringer液倒入100mL烧杯中，并将烧杯埋于冰中冷却得到冰冷的Ringer液，冰冷的Ringer液中持续充入95％氧气和5％二氧化碳的混合气体；在一个载玻片上滴上充气后的冰冷Ringer液，随后用眼科剪快速剪取连带触角的昆虫的头，并将其放入载玻片上的Ringer液中，在体式显微镜下，使用尖头镊子和眼科剪，在3～5分钟内，迅速地将带触角的脑完整地从头囊中分离出来，并用镊子除去脑表面的气管、气囊，并使用1mL注射器针头的锋利三角形尖端将与鞭节连接处的梗节角质层部分切除，然后，使用Ringer液清洗3遍；

(3)组织显色：将步骤（2）得到的昆虫触角和脑上滴上红氨酸溶液，在体视显微镜下随时观察显色情况；一旦触角和脑内神经束被标记出来，则快速用干燥滤纸条吸除红氨酸溶液，并用100％酒精清洗3次，清除组织内外多余的红氨酸，防止过度显色；

(4)组织固定：用尖头镊子轻轻地将步骤（3）得到的显色后的昆虫触角和脑转移到一个干净的PCR管中，依次滴上2-4滴5%和10%的甲醛溶液，各固定10 分钟，最后用干燥的滤纸条吸除甲醛溶液；

（5）组织脱水：用尖头镊子轻轻地将步骤（4）固定后的昆虫触角和脑转移到另一个干净的PCR管中，依次用70%、80%、90%、100%的酒精进行脱水，各脱水5分钟；

（6）组织透明：将步骤（5）脱水后的昆虫触角和脑浸入水杨酸甲酯中，室温条件下放置1-12h，触角外骨骼角质层、触角内组织和脑被透明化；

(7)姿态调整和固定：体式显微镜下在小井装置中使用尖头镊调整和固定步骤（6）处理后的昆虫触角和脑的姿态；

(8)显微拍照：将步骤（7）姿态调整和固定后的触角和脑置于显微镜下获取不同放大倍率下触角内神经纤维束的图像信息，根据需要调整触角的姿态并固定，获取所需角度的图像信息。

2.根据权利要求1所述昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于：步骤(7)调整和固定昆虫触角和昆虫脑的姿态的具体操作方法为：将步骤（6）处理好的昆虫触角和脑转移至姿态固定装置的小井装置中的石英砂上，并在小井装置中滴入低粘稠度高透光度的水杨酸甲酯，用尖头镊子小心移动触角和石英砂，根据需要，可将触角从背侧、腹侧、外侧、内侧和顶端等不同方向和角度进行姿态调整和固定。

3.根据权利要求1所述昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于：步骤(1)中氯化镍溶液或氯化钴溶液的质量浓度为1％～10％，设昆虫触角长度为n毫米，则浸染时间为n～n+5小时。

4.根据权利要求1所述昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于：所述的加样枪头的体积为10μl 、200μl或1000μl。

5.根据权利要求1所述昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于：所述的毛细玻璃管或玻璃电极的尖端口径为昆虫触角宽的1-2.5倍。

6.根据权利要求1所述昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于：所述步骤(7)中的小井装置的高度不超过5mm，其内设置石英砂。

7.根据权利要求6所述昆虫浅色触角内神经纤维束示踪的方法，其特征在于：所述石英砂为两种不同的尺寸，石英砂的粒径为样本最小尺寸的1/5-1/2，两种粒径石英砂的质量比为1:(1～3)。