[发明专利]一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定殖的方法

说明书

本发明公开了一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌研究生防菌在植株上的定殖的方法，涉及基因工程技术领域，将所述表达黄绿荧光蛋白的生防菌按照待研究的生防菌施用方法对植物进行施用，检测施用部位生防菌的种群分布情况，定植的生防菌的种群数量越多、越稳定，该施用方法的定植效果越好，根据实际需求选择生防菌的使用方法。该方法不需特殊仪器，而且重复性较好。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌及其构建方 法与应用。

背景技术

大量研究表明，生防菌在植物根围和叶围能否有效定殖是生防菌能否起到稳定持久防 病效果的一个重要因素。其定殖能力受菌株自身的特性和周围环境中诸多因素的影响。由 于植物体内存在内生细菌，植物表面和土壤中存在多种细菌，而这些细菌的菌落形态很难 区别，由于受这些细菌的干扰，很难确定野生型的生防菌在植株根围和叶围的定殖情况。 目前研究生防菌在植株根围和叶围的定殖，应用最多的方法是用利福平诱导抗性菌株，该 方法需要逐步提高利福平的诱导浓度，耗时较长，并且获得性抗性菌株稳定性较差。用基 因标记菌株进行生防菌定殖研究报道较少，田涛等人借助于荧光显微镜，定性研究了绿色 荧光蛋白标记的生防芽孢杆菌在小麦根部能够定殖，该方法需特殊的仪器和较高的技术。

生防菌在实际应用中会受到很多因素的影响，生防菌被引入土壤和叶面之后后，往往 会受到原著菌群的抑菌作用以及生防菌与植物根部和叶部亲和能力的影响，这是导致生防 菌在实际应用中防效不稳定的重要原因之一。因此，生防菌能否在靶植物根际和叶围定殖 是生防菌能否发挥稳定作用的重要原因之一，也是筛选、评定生防菌的一个重要指标，并 最终决定该生防菌是否具有产业化前景。研究生防菌的定殖及其对原著微生物的影响具有 重要的理论意义和现实意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明采用SP盐方法将荧光蛋白基因导入野生型生防菌株中，通 过菌体发荧光特性、质粒DNA双酶切和SDS-PAGE鉴定，获得1株具有较强荧光表型的基因标记菌株，并且提供了利用上述基因标记菌株研究研究生防菌在植株上的定殖的方法。

首先，本发明提供一种表达黄绿荧光蛋白的生防菌，所述生防菌为重组菌，宿主菌为 野生型生防菌株BS-17，宿主菌中转化有含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体。

所述野生型生防菌株BS-17在《生物技术》2011年第03期中公开，文章标题为《生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究》，作者于德水、高娃、沙长青、张淑梅、 高继国。

所述pHPS9质粒为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒表达载体，结构如图1所示，含有CmR基因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，从上游到下游依次的顺序为CmR基 因、ORI332基因、PxylR基因、lacZ基因，lacZ基因在CmR基因的上游；所述EYFP基因 为增强型黄绿荧光蛋白基因。

所述含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体，其结构为，在pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点连接有EYFP基因。

所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。

所述双酶切位点为BamHI酶切与EcoRI酶的双酶切位点。

第二，本发明提供上述表达黄绿荧光蛋白的生防菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将EYFP基因连接到pHPS9质粒的lacZ基因和CmR基因之间的双酶切位点，得 到含黄绿荧光蛋白基因的穿梭质粒表达载体；

(2)将步骤(1)所得的表达载体转化到野生型生防菌株BS-17中，即得到表达黄绿荧光蛋白的生防菌。

步骤(1)所述双酶切位点位于pHPS9质粒的lacZ基因下游，CmR基因上游。