[发明专利]一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用

说明书

一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程和蛋白质工程领域。针对丙酰辅酶A羧化酶酶活较低，以及如何对丙酰辅酶A羧化酶进行高通量筛选的问题，本发明提供了一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌，所述重组菌是以草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌为宿主菌，在所述宿主菌中过表达甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC，本发明还提供了能够提高丙酰辅酶A羧化酶pcc酶活的单一位点突变体以及多位点突变体。本发明可实现丙酰辅酶A羧化酶基因pcc的CT亚基高通量筛选。

技术领域

本发明具体涉及一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程和蛋白质工程领域。

背景技术

丙酰辅酶A羧化酶在微生物次级代谢产物的合成中发挥着非常重要的作用，是微生物体内脂肪酸生物合成、聚酮类物质合成、甲醇同化、乙酰辅酶A同化等途径的关键酶。人体内PCC功能低下则会引起丙酸血症、癫痫等疾病。许多大环内酯类抗生素比如红霉素，泰乐霉素，阿维菌素等的生物合成，很多药物如FK506等的生物合成，也均需要丙酰辅酶A羧化酶的参与。目前丙酰辅酶A羧化酶酶活较低，且缺少丙酰辅酶A羧化酶的简易高通量筛选方法，使得对pcc的优化难以有效的开展。

发明内容

针对丙酰辅酶A羧化酶酶活较低，以及如何对丙酰辅酶A羧化酶进行高通量筛选的问题，本发明提供了一种筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌，所述重组菌是以草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌为宿主菌，在所述宿主菌中过表达甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct，乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB和乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC；所述丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基在NCBI中蛋白ID为：SMX58101。

进一步地限定，所述草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，为敲除了谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck的大肠杆菌。

进一步地限定，所述谷草转氨酶基因aspC在KEGG数据库中的查询号为EC2.6.1.1；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc在KEGG数据库中的查询号为EC 4.1.1.31；所述苹果酸脱氢酶基因mdh在KEGG数据库中的查询号为EC 1.1.1.37；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck在KEGG数据库中的查询号为EC:4.1.1.49。

进一步地限定，所述乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB在NCBI中基因ID为：947758；所述乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC在NCBI中基因ID为：947761；所述甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括如下步骤：

1)构建过表达中间载体：将甲基丙二酸单酰辅酶A羧基转移酶基因mct、乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基基因accB及乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因accC接到pACYCDuet质粒中，获得重组载体pACYCDuet-mct-accB-accC；

2)构建草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌菌株：通过CRISP/Cas9基因编辑方法敲除大肠杆菌中谷草转氨酶基因aspC，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，苹果酸脱氢酶基因mdh和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶基因pck，获得草酰乙酸营养缺陷型的大肠杆菌，Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck；

3)将步骤1)中所获得的重组载体，转化到步骤2)获得的宿主EscherichiacoliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck感受态细胞中，获得筛选丙酰辅酶A羧化酶pcc的CT亚基的重组菌Escherichia coliBL21(DE3)△aspC△ppc△mdh△pck-pACYCDuet-mct-accB-accC。