[发明专利]猪源杂合防御肽PL-5及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种猪源杂合防御肽PL‑5及其制备方法和应用，其序列如序列表SEQ ID No.5所示。本发明首先分析猪源防御肽PMAP‑23的氨基酸组成和排列特点，通过取代或截取方式取得N末端或C末端区域，并与LPS绑定序列相互连接，获得不同长度的杂合肽；然后使合成多肽；将合成的多肽进行纯化，并利谱法进行鉴定；最后，通过最小抑菌浓度和溶血试验测定猪源杂合肽的抑菌活性和细胞毒性，筛选具有较理想活性的多肽。本发明的有益效果：(1)该多肽衍生自猪源防御肽PMAP‑23，安全性较好，具有广谱抗菌活性和无残留特点；(2)该多肽由23个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源杂合防御肽PL-5及其制备方法和应用。

背景技术

目前，在动物生产中使用抗生素治疗和预防病菌感染对于保证动物健康发挥重要作用，应用十分普遍。但是，细菌耐药性和药物残留等问题随抗生素的长期滥用而逐渐凸显，严重破坏养殖业的可持续发展，间接威胁人类的健康和食品安全。近年来许多国家已经禁止部分抗生素的使用，因此需要研究一种新型的有效传统抗生素替代物，保证动物的健康养殖。研究发现，防御肽具有不同于传统抗生素的抑菌机制，不易使病菌产生耐药性，同时还具有热稳定性强、抗酶解、无残留等优点。

已知，猪源防御肽PMAP-23在猪的自身免疫和抗病方面发挥重要的生物学作用。结合生物信息学等分析方法，发现PMAP-23富含疏水性和正电荷残基，这对其抗菌活性具有重要作用。但是，PMAP-23的最小抑菌浓度达到2-8μM范围，溶血活性在128μM时即达到5％，其治疗指数仅为36，远低于实际应用所要求的阈值。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猪源杂合防御肽PL-5及，该杂合肽衍生自猪源防御肽PMAP-23，其治疗指数达到288，具有高抑菌活性和低毒性，安全性较好，具有广谱抗菌活性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪源杂合防御肽PL-5，其序列如序列表SEQ ID No.6所示。

本发明的另一目的在于提供一种猪源杂合防御肽PL-5的制备方法，该杂合肽由23个氨基酸组成，肽链较短，制备方法和技术成熟，合成成本低，制备方法步骤如下：

(1)根据猪源防御肽PMAP-23的疏水性氨基酸和电荷分布特点，通过取代或截取PMAP-23的C末端或N末端部分残基，并与脂多糖绑定序列：GWKRKRFG相互连接，获得氨基酸长度从16至23不等的杂合肽，它们的序列分别如序列表SEQ ID No.1-6所示；

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成多肽；

(3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备；

(4)通过最小抑菌浓度和溶血试验测定衍生抗菌肽的抑菌活性和细胞毒性，发现肽PL-5的最小抑菌浓度为1-2μM，强于其它杂合肽的抑菌活性；而在256μM浓度未发现溶血性，证明其无毒性，综合抑菌活性和溶血活性，肽PL-5的治疗指数为288，为所有杂合肽中最大，从而选取杂合防御肽PL-5，其序列如序列表SEQ ID No.5所示。

本发明的另一目的在于提供以上所述的一种猪源杂合防御肽PL-5在治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。