[发明专利]基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料及其制备方法

权利要求书

1.一种基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用非酶解冷提法从鹿茸中提取天然活性成分鹿茸小分子多肽以及活性多糖，并从不溶性提取滤渣中获取脱脂鹿茸粉；其主要步骤为：

S1：在低温和缓冲液存在条件下冷提取鹿茸水溶性组分，得到鹿茸粗提物，过滤；

S2：对滤渣进行脱脂处理得到脱脂鹿茸粉；

S3：柱层析分离，得到小分子多肽组分及多糖组分；

S4：对多糖进行纯化处理得到富含硫酸软骨素类蛋白聚糖的鹿茸活性多糖；

(2)制备含纳米磷酸三钙的明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料；

(3)制备鹿茸小分子多肽-纳米羟基磷灰石微球复合物；

(4)材料成型：将所得小分子多肽-纳米羟基磷灰石微球复合物用0.5-1wt％的鹿茸活性多糖溶液分散，形成分散液；将明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料置于分散液中，在4℃条件下，使其负载微球复合物及活性多糖组分，真空冷冻干燥，得到所述基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料；

其中，步骤(1)具体操作如下：

S1：取冷冻梅花鹿鲜茸，切片，加入预冷至4℃的提取缓冲液，组织粉碎后匀浆1-3h，匀浆期间补充缓冲液，匀浆后于4℃温度下低速搅拌12-16h；搅拌混合液于4℃下离心15-20min，收集上清液组分；所得沉淀用缓冲液重悬，搅拌1-2h后再次离心，合并上清组分，微滤膜过滤除杂；低温真空浓缩，得鹿茸粗提物浓缩液；其中，所述缓冲液组成为：NaCl，Tris-HCl，醋酸钠，pH6.7-6.8；鲜茸与总缓冲液的用量比为1kg:5-10L；

S2：将离心沉淀依次用乙醚、乙酸乙酯脱脂处理，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂，所得滤渣即为富含胶原不溶性组分的脱脂鹿茸骨粉，冷冻干燥保存；

S3：将鹿茸粗提物浓缩液进行柱层析，去离子水洗脱，紫外监测多肽活性峰，收集非紫外部分水溶性组分1，以及含蛋白及多肽的组分2；将组分2合并后浓缩，超滤膜过滤，收集滤液，纳滤膜除盐，获得小分子多肽组分，减压浓缩，真空冷冻干燥得到多肽干粉，低温保存；

其中，将组分2用截留分子量为3000-4000Da的纤维超滤膜过滤；

S4：将含多糖及无机矿物质的水溶性组分1合并后浓缩，透析除去小分子杂质，得到活性多糖粗品；将多糖粗品透析液加入无水乙醇进行醇沉处理，离心收集沉淀，洗涤，干燥，得到富含硫酸软骨素类蛋白聚糖的鹿茸活性多糖组分；其中，所述透析用截留分子量为8-10KDa的透析袋进行透析；

其中，步骤(2)具体操作如下：

S1：按质量比10:0-3的比例将明胶和水溶性组分2中分离小分子多肽后的蛋白滤渣配制成3-5wt％的分散液，加入纳米磷酸三钙至质量分数0.5-1.5wt％，50℃高速匀浆0.5-1min，然后室温静置冷却；

S2：向上述混合物中加入交联剂溶液，混合溶液与交联剂溶液体积用量比为20-50:1，搅拌条件下于37-42℃交联15-30min，交联反应后加入上述制备的脱脂鹿茸粉至质量分数0.5-1wt％，继续搅拌10-15min，然后静置降温至室温，抽滤，用乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥，获得淡褐颗粒型骨架材料；其中，所述交联剂溶液为0.5-1wt％的戊二醛；

其中，所述步骤(3)的具体操作如下：

将上述制备的小分子多肽以20-50mg/mL的浓度溶解于1wt％的纳米羟基磷灰石水分散液中，加入等摩尔比例的N-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸酯类交联剂，控制N-异丙基丙烯酰胺浓度0.5-1mg/mL；氮气气氛下磁力搅拌均匀后，加入N，N二甲基丙烯酰胺至浓度1-2mg/100mL，以1-1.2wt％过硫酸钾溶液作为引发剂，在4℃下进行交联反应1-2h，产物离心后透析以移除未反应单体，得到鹿茸小分子多肽-纳米羟基磷灰石微球复合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述丙烯酸酯类交联剂选自甲基丙烯酸乙二醇酯；所述过硫酸钾溶液体积用量为分散液的5-10％。