[发明专利]表达可溶性PD-1的嵌合抗原受体CAR基因及应用

说明书

本申请公开了一种表达可溶性PD‑1的嵌合抗原受体CAR基因及应用。所述CAR基因包括依次顺序连接的抗原结合结构域基因、跨膜结构域基因、胞内结构域基因和可溶性PD‑1基因，所述可溶性PD‑1为PD‑1的胞外段区域，优选的，所述可溶性PD‑1包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本申请可使CAR‑T细胞在肿瘤微环境内分泌sPD‑1，通过sPD‑1与肿瘤细胞表面PD‑L1结合，竞争性抑制与CAR‑T细胞表面跨膜PD‑1结合，从而避免CAR‑T细胞被抑制，提高CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤治疗效果，达到对肿瘤尤其是实体瘤治疗目的。本申请为提高CAR‑T细胞杀伤肿瘤细胞效果提供了一种新途径。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种表达可溶性PD-1的嵌合抗原受体CAR基因及应用。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病，其治疗方法一直受到医学及生物学界的高度关注。近年来，随着人们对肿瘤免疫微环境认识的不断深入，一种治疗肿瘤的新思路逐渐走入人们的视野，即“肿瘤免疫治疗”，2013年，美国FDA称其为“突破性疗法”，足以见其重要性，而嵌合抗原受体T细胞治疗(CAR-T)是目前最具前景的肿瘤免疫治疗之一。

嵌合抗原受体CAR一般由一个抗原结合区/胞外区/跨膜区以及一个在结合抗原后能够活化T细胞的胞内信号区组成，CAR-T细胞较正常的T细胞具更高的潜能，因其是经一种非MHC分子依赖性的、特异性的、单一信号的途径激活。临床前和临床试验的一些深入研究显示CAR-T疗法在对多种癌症治疗中取得了令人鼓舞的治疗效果，特别是用CD19-CAR-T治疗B细胞恶性肿瘤。目前，CAR-T细胞免疫治疗恶性血液病已取得显著的临床反应。然而，用CAR-T细胞治疗实体瘤受到实体瘤组织结构强大的免疫抑制环境所限制，理想靶标的缺失也是治疗实体瘤的另外一个关键不足。因此寻找更有效的靶点从而推进CAR-T细胞治疗实体瘤是现阶段的一大重要挑战。

PD-1是程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-1属Ι型跨膜蛋白，由胞外段、跨膜锚定区以及胞内信号转导区三部分构成，主要诱导表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞表面。PD-1的配体是B7-H1(PD-L1)和B7-DC(PD-L2)，二者结合后抑制T细胞增殖活化，对T细胞应答起负调节作用，属于抑制性受体。肿瘤细胞表面常表达PD-L1，与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞增殖活化，实现免疫逃逸。目前市场上已经有PD-1和PD-L1抗体，阻断肿瘤细胞对T细胞的抑制作用。在人体内除了存在跨膜结合蛋白PD-1，也存在可溶性PD-1(sPD-1)，sPD-1保留了模型分子的胞外Ig V-Ig C样结构域，能够结合于配体PD-L1和PD-L2。最初有关sPD-1的研究多与自身免疫疾病相关，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、重度肌无力等自身免疫疾病均被证明与sPD-1有关，sPD-1也被认为是在自身免疫疾病中，由免疫细胞在促炎症刺激因子的作用下产生。同样，sPD-1具有与PD-L1结合的能力，起到抑制T细胞活性的功能。

目前，尚无将可溶性PD-1与嵌合抗原受体CAR共表达提高CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤力的产品。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种表达可溶性PD-1的嵌合抗原受体CAR基因及应用，本发明可使CAR-T细胞在肿瘤微环境内分泌sPD-1，通过sPD-1与肿瘤细胞表面PD-L1结合，竞争性抑制与CAR-T细胞表面跨膜PD-1结合，从而避免CAR-T细胞被抑制，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤治疗效果，达到对肿瘤尤其是实体瘤治疗目的。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

本发明首先提供了一种表达可溶性PD-1的嵌合抗原受体CAR基因，所述CAR基因包括依次顺序连接的抗原结合结构域(即一段胞外单链抗原可变区片段scFV)基因、跨膜结构域基因、胞内结构域基因和可溶性PD-1基因，所述可溶性PD-1为PD-1的胞外段区域，