[发明专利]一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法

说明书

本发明涉及一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，包括：制备无顶芽茎段，无顶芽茎段的预培养，制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段，无顶芽茎段的暗培养，无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植；无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构，相对叶背浸润法与茎基注射法，容纳相同浓度的农杆菌菌液的空间更大，而采用注射方式能对接种液的体积进行精确定量。此外，本发明利用了病毒更易侵染植物幼嫩芽叶的特性，特别适合于病毒介导的遗传转化或病毒的接种，且明显促进了病毒介导的基因沉默效果、加快了DNA病毒的侵染速度和效率，适用于扦插易成活、有腋芽的植物，具有较好的应用价值。

技术领域

本发明涉及农业技术领域，更具体的说是涉及一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法。

背景技术

植物的遗传转化是研究基因功能以及获得转基因植物的途径，常用的方法有基因枪法、蘸花法、农杆菌介导法等。

DNA病毒引起的病毒病是近年来危害作物生产的重要病害，尤其是番茄黄化曲叶病毒：tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)严重危害我国番茄的生产。鉴定和选育抗病品种是防治病毒病的有效途径。利用含有病毒侵染性克隆的农杆菌培养液，通过叶背浸润法和茎基部注射法是接种DNA病毒的两种常用方法。

但是，现有植物的遗传转化的方法，或应用成本高、转化步骤繁琐，或转化植物的成活率不高、转化效率低下。现有接种DNA病毒方法，存在以下不足：叶背浸润法接种只能每片叶片依次接种，浸润时速度缓慢、力度不易把控、渗入叶片的农杆菌的菌液量有限且无法准确定量；茎基部注射法容易破坏幼苗茎部组织、农杆菌不易注入、注射量不易控制等，仅可以满足少量幼苗接种需要，而当鉴定植物抗性需要大量接种时，则耗时、低效。

因此，提供一种植株快速遗传转化或感染DNA病毒的方法以提高效率、节省时间为本领域技术人员目前亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种植株快速遗传转化或感染DNA病毒的方法，解决了传统遗传转化方法应用成本高、转化步骤繁琐、转化效率低下，以及DNA病毒接种速度慢、定量困难的问题。特别适用于扦插易成活且具有腋芽的植物。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种植株快速遗传转化或感染病毒的方法，包括如下步骤：

(1)制备无顶芽茎段：将植株顶芽切掉，将茎切成若干个带有一个侧枝或一片复叶的茎段，筛选出其中含腋芽的茎段；

(2)无顶芽茎段的预培养：将人工剪取的无顶芽茎段种在培养基质中培养；

(3)制备农杆菌菌液并注射于无顶芽茎段：制备含有病毒介导的基因沉默载体的农杆菌菌液和/或含有DNA病毒侵染性克隆的农杆菌菌液，并将其注射于无顶芽茎段；

(4)无顶芽茎段的暗培养：置于黑暗条件下培养；

(5)无顶芽茎段腋芽的剥离，腋芽的种植；将暗培养结束的茎段继续培养，将表现症状的腋芽从茎段上取下，种于培养基质中培养。

优选的：步骤(1)制备无顶芽茎段具体为：取35-40cm高的植株，将顶芽切掉，将茎切成若干个带有一个侧枝或一片复叶的茎段，每个茎段长4-6cm，茎的形态学上端切口为平切口，形态学下端切口为30°，筛选出其中含腋芽的茎段，腋芽长度为1-3cm；茎段的形态学上切口距离侧枝或复叶基部为2.5-3.5cm，形态学下切口距离侧枝或复叶基部为1.5-2.5cm。

优选的：侧枝长度大于10cm，则切断侧枝顶部，保留侧枝3-5片叶。

优选的：无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构。

无顶芽茎段具有不对称“Y”型结构，相对叶背浸润法与茎基注射法，容纳相同浓度的农杆菌菌液的空间更大，而采用注射方式能对接种液的体积进行精确定量。