[发明专利]快速分离提取表皮干细胞的方法

说明书

本发明公开一种快速分离提取表皮干细胞的方法，包括如下步骤：(1)用TrypLE Select消化液消化皮片；(2)分离表皮和真皮，刮取和收集表皮基底细胞；(3)纯化、离心去上清后加培养基重悬表皮基底细胞；(4)将表皮基底细胞接种到用纤连蛋白包被的细胞培养容器中培养；(5)洗去未贴壁细胞，贴壁细胞即为表皮干细胞。本发明提供的快速分离提取表皮干细胞的方法简单易行，对细胞损伤小，可在短时间内分离和提取得到表皮干细胞，可达到快速分离提取的效果，获得的表皮干细胞不仅纯度高、数量多，而且活性强，1cm²皮片可获取细胞数约1.5×10⁵个，活性达到85％以上。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种分离提取表皮干细胞的方法。

背景技术

创面是机体由于内在或外在的因素导致皮肤完整性丧失所形成的，其修复一直以来是临床中的急需解决的问题。临床上按时间可将创面划分为急性创面及慢性创面。急性创面包括烧伤、创伤等重大疾病或者瘢痕、皮肤色素性疾病、良恶性肿瘤等手术切除后形成的皮肤缺损，慢性创面包括外伤性溃疡、糖尿病性溃疡、血管性溃疡、压力性溃疡、放射性溃疡、肿瘤性溃疡、瘢痕性溃疡等等形成的皮肤缺损。

大面积烧伤患者往往存在皮源短缺的问题，暴露的创面又往往成为创面感染迁延不愈，甚至发展为脓毒血症，危及生命，更为重要的是治愈后也往往形成瘢痕增生，皮革样皮肤，由于瘢痕的形成而没有汗腺、没有毛囊、没有皮脂腺，所以这种患者伤好之后，痛不欲生，因为这类患者到夏天不能排汗，生活质量受到严重影响。慢性创面的发病率呈逐年上升趋势，其病程长，难愈合，植皮成活率低，植皮后皮肤功能丧失，生活质量下降，社会负担沉重。有文献报道，全世界约有1％的人遭受到难愈性创面的困扰，5％左右的医疗费用被用于创面修复。每年在美国有6万至8万人因为急性皮肤损伤而入院治疗，每个患者需花费36000至117000美元。在美国每年的烧伤患者高达150万人，其中75000人属于严重烧伤，由于治疗不及时或感染等原因导致的死亡人数在5000～12000之间。在中国，每年因为烧伤、机械损伤或慢性皮肤溃疡而需要医治的者高达更高达320万人。据美国创面愈合协会资料显示，超过60％的慢性创面经半年的治疗后仍无法完全愈合，每年的医疗费极高。欧洲每年投入慢性创面治疗的费用则占卫生健康财政支出的2％，同时，创面修复后因瘢痕增生而修复的医疗费用也高达120亿美元，而且，这些费用每年仍在增加。

手术修复是目前治疗创面的主要方法，但是，无论是传统的皮片移植、皮瓣移植、邮票皮移植、微粒皮移植、网状皮移植、复合皮移植等，还是新兴的组织工程皮肤，目前都未能有效的解决创面修复的难题。尤其是重大疾病烧伤患者康复后往往瘢痕增生，汗腺缺失，皮肤失去原有的功能，生活质量低下；慢性创面则迁延不愈，轻者极大消耗医疗资源，重者并发感染、脓毒血症等严重危害生命。

现有研究表明在创面上喷洒表皮细胞悬液(主要含有表皮细胞、成纤维细胞、黑色素细胞等)能提高创面愈合率，改善远期皮肤愈合质量，甚至能修复部分皮肤附属器官，如汗腺等。但目前获取细胞悬液的方法主要为胰蛋白酶消化法，方法耗时较长，且受消化条件(如酶的种类、浓度、反应温度、反应时间等)、皮片厚度等因素的影响，制备得到的细胞悬液中细胞活性不高，不能满足临床上立即进行细胞悬液移植的需要，故目前临床上用于移植的细胞悬液中的细胞都是分离后的细胞经过培养后获得的细胞，由此不仅延长了患者的住院时间，对于大面积创面患者还容易诱发全身性感染，同时，该方法还需要较高的实验条件，耗时耗力，在基层医院难以推广应用，同时患者还得经受两次手术的痛苦(取皮一次，细胞悬液移植一次)。