[发明专利]一种二倍体毛白杨的遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，首先采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，清洗消毒后依次进行增殖继代培养、芽伸长培养和生根培养，得到毛白杨无菌苗，挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，制备菌液作为侵染液；将毛白杨无菌苗的叶片切成叶盘，培养7d后转入侵染液中进行侵染，侵染后的叶盘先黑暗培养后光照恢复培养，最后进行抗性芽的筛选，得到候选植株，对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将均为阳性的植株进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株。本发明方法具有转化效率高、培育周期短、可大规模投入生产等优点，二倍体毛白杨的遗传转化体系可为规模化培育新品种、定向改造优良性状提供帮助。

技术领域

本发明涉及一种毛白杨的遗传转化方法，尤其是一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

杨树(Populus)作为杨属杨柳科中一类植物的总称，在中国大部分地区都有分布，杨属植物在我国有几十个种，其具有生长指标好，树形高大优美，对不良环境适应性强等特点。杨属植物天然种质资源极为丰富，是全球温带气候中种植量最大的树种之一。毛白杨(Populus tomentosa)作为中国的乡土杨树品种，具有生长速度快，环境适应性强等特点，我国的毛白杨数量庞大，遍布于我国黄淮海流域100多万平方公里的10多个省、市、自治区。毛白杨生长迅速，适应性强，纤维较长，材质优良、树干高大通直，树形美观，是民用、建筑、家具用材和纤维工业的重要原料，也是杨属中最适于作为纸浆材原料的优良树种之一。但是由于生长周期长、树体高大，异花授粉和杂交不亲和性等原因，极大地限制了杨树传统育种工作的开展。植物基因工程的兴起，为毛白杨遗传改良提供了新的途径。通过植物遗传转化将外源基因引入到植物细胞并使其稳定地遗传和表达，从而获得新的生物学性状，开辟了毛白杨育种的新途径。

Parson等(1986)最早对利用根癌农杆菌对杨树进行了遗传转化并证明了外源基因可以在杨属植物中表达。Fillattid等(1987)将抗除草剂基因aroA转入了银白杨与大齿杨杂交的一种无性系中，从此开始了现代杨树转基因技术的研究。毛白杨不易通过传统育种的方法提高植物对于恶劣环境的抗逆性，而基因编辑技术可以针对性的提高毛白杨的抗逆性。现如今，常见的转基因技术都已运用于杨树的遗传转化研究中。郝贵霞等(1999)在获得再生体系的基础上，利用雌性毛白杨回交植株作为材料，成功转入了豆类蛋白酶抑制剂基因。等等。

与其它杨属植物不同的是，毛白杨在自然条件下存在大量的野生三倍体与二倍体混植，由于三倍体毛白杨较二倍体毛白杨在树形上较为高大，作为我国部分地区的行道树与观赏树种，分布广泛，所以目前对毛白杨的遗传转化体系多为针对三倍体毛白杨的，并且其再生植株生根发育困难，难以形成完整植株，而且通常采用的是传统的根癌农杆菌介导法，获得转基因植株的效率一般不足50％且多为假阳性。

目前，对二倍体毛白杨遗传转化方面的相关研究很少。二倍体毛白杨作为我国乡土树种，仍存在生长速度慢等问题。本发明人在国内外现有研究基础上，探索目前缺失的雄性二倍体毛白杨再生转化体系，通过分析影响再遗传转化系的因素，筛选出各影响因素的优化组合，旨在提供一种雄性二倍体毛白杨的再生体系，以提高杨树的生长速度，为雄性二倍体毛白杨后续遗传研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，该方法具有转化效率高、培育周期短、可大规模投入生产等优点。

技术方案

一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)毛白杨无菌苗的获得：